【文章內(nèi)容簡介】 不銹鋼材質(zhì)，耐強有機溶劑，不耐酸，Cl ， EDTA等螯合離子 ， 鹽等蛋白純化試劑）。 ? 層析柱或?qū)游鼋橘|(zhì)是層析分離實現(xiàn)的場所，現(xiàn)代蛋白液性層析儀兼容所有蛋白層析介質(zhì)，不存在所謂 “ 有利發(fā)揮介質(zhì)特性的層析儀 ” 。 ? 工藝移植和同一介質(zhì)的不同粒度有關(guān)，一般和儀器無關(guān)，除非儀器集成度不高，死體積太大。 ? 很多功能是競爭的產(chǎn)物，非必要，更非業(yè)界標(biāo)準(zhǔn)。 蛋白質(zhì)純化平臺 分子生物學(xué)實驗室的層析 姜韜 0 100 200 300 400 500 600Vo lum e( m l)OD280nm U V050100150200250HIC for FABPConductivity(mS/cm) C o n d u c tiv ity引言 ? 現(xiàn)代生物學(xué)研究的發(fā)展，為分子生物學(xué)實驗帶來新的課題和挑戰(zhàn)。目標(biāo)ＤＮＡ的功能研究其中相當(dāng)?shù)墓ぷ餍枰蛛x純化表達(dá)了的基因產(chǎn)物－目的蛋白。研究其活性并制備抗體進(jìn)行更深入的功能探討。 ? 生物技術(shù)的發(fā)展，特別是以液相層析為核心的生化分離技術(shù)的日益成熟和完善為分子生物學(xué)實驗室提供了這種充分的條件。 ?生物技術(shù) (Biotechnology)有三大部分：生化分離技術(shù)； DNA重組及基因轉(zhuǎn)移技術(shù)；免疫檢測技術(shù)。其中生化分離技術(shù)是生物技術(shù)的基礎(chǔ)和支柱。 ?層析 (chromatography)是最有效的分離手段，也是最重要的蛋白質(zhì)純化工具。層析主要是物理方法，是混合熵減少的過程，必然消耗自由能。 ?基因工程下游的核心是層析。 ?層析技術(shù)的理論與實踐已高度發(fā)展和完善。 蛋白質(zhì)純化平臺將成為分子生物學(xué)實驗室的基本內(nèi)容 ? 分子生物學(xué)家運用的分離純化技術(shù)具有平臺的特征 生化學(xué)家分離未知蛋白 ? 規(guī)模較小，目標(biāo)蛋白含量往往極低； ? 各步驟用活性分析和蛋白分析嚴(yán)密監(jiān)控； ? 針對性強，過程復(fù)雜，不可移植； ? 產(chǎn)物純度要求高，往往用于測序。 基因工程下游分離已知蛋白 ? 規(guī)模較大，目標(biāo)產(chǎn)物含量較高； ? 重視純化過程的技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)； ? 有較強的針對性，移植性很差； ? 產(chǎn)物純度要求高，通常有特殊要求： 無病毒，無 DNA，無內(nèi)毒素。 分子生物學(xué)實驗室需分離已知蛋白 ? 規(guī)模??； ? 目標(biāo)蛋白含量較高，往往是高表達(dá)的產(chǎn)物，往往大于 5%； ? 純度和回收率往往要求較低，電泳純； ? 步驟少，硬件結(jié)構(gòu)有通用性。 蛋白質(zhì)純化平臺的結(jié)構(gòu)和組成 ? 含量較高的蛋白質(zhì)純化，基本可以在三個層析步驟中實現(xiàn)。 ? 利用目標(biāo)蛋白的三個獨立的物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行層析分離。 分離機制 ? 分子的大小 凝膠過濾 (sizeexclusion)（分子篩，分子排阻） ? 分子的電性 離子交換（ IEC）陽離子交換、陰離子交換 ? 分子的表面疏水結(jié)構(gòu) 疏水層析（ HIC） ? 其它：羥基磷灰石，反相，金屬螯合 (IMAC)，親和，染料配基介質(zhì)層析 ? 精制（ polishing）：高分辨率層析 純化平臺的硬件結(jié)構(gòu) ? 中心設(shè)備：中壓至高壓層析儀 ? 輔助設(shè)備：過濾裝置，超濾裝置，離心機，蛋白質(zhì)電泳等 層析柱 ?不同性能的層析柱； ?層析柱裝填：（ 1）均勻；（ 2）緊密 ?柱效評價：理論塔板 板高 ?不同粒度近似關(guān)系為： H?dp2 ?在裝填良好的情況下，通常：凝膠過濾 H ? 2dp； 離子交換、疏水 H? 3 dp N VW? ??????5 541 22./H LN?? 經(jīng)驗：具有 3000個理論塔板的凝膠過濾可近似地將分子量相當(dāng) 2倍的蛋白質(zhì)完全分開； 6000個理論塔板可分開相差 。 ? 通常， 3000個塔板如用 BioGel P(fine)或 BioGel A(fine)，流速 20cm/h（參照產(chǎn)品說明書） 應(yīng)在 80cm以上至 120cm，上樣 5%，一般 12%。 ? Scope建議： 柱直徑： D=(M/10)1/3 D:cm； M:蛋白量（ mg） 而 L=30D L： cm ?實驗室規(guī)模的層析應(yīng)采用不大于 50?m的離子交換或疏水介質(zhì)，應(yīng)具有 10cm左右，則不少于 600個理論塔板。 ?精制：高效預(yù)裝柱 1 5ml， 10?m左右粒度，如 Mono系列； BioScale； TSK等。 平臺的操作（軟件：知識結(jié)構(gòu)） ? 樣品處理及準(zhǔn)備工作 ? 用 SDSPAGE監(jiān)測整個流程 ? 富含目標(biāo)蛋白的提取物的獲得：應(yīng)采用盡量低強度的抽提方法。通常 PBS或 TBS抽提能力過強，沒有必要 .低滲更有利于破碎，甚至可用水進(jìn)行抽提（如 1： 4左右）。 ? 無特殊理由， pH應(yīng)準(zhǔn)確控制在中性附近，盡量用酸性 buffer； ? 最好運用（ NH4） 2SO4沉淀，縮小體積，便于保存。終止生化代謝反應(yīng)，除糖、脂類。個別情形中會造成不可逆沉淀； ? ，沒有特殊原因不要使用超聲破碎法。 ? 0?C ， 20%蔗糖， 10mM左右緩沖液，含 ? 高滲后，加入低滲液，迅速充分懸浮。如果必要，應(yīng)含 DTT至 2mM左右。 ? 均漿液組成原則：離子強度盡量低： ?50mM，有時需 DTT，不一定加 EDTA，可考慮加PMSF，但此時不宜用 Tris等胺類緩沖劑。 樣品通常特點及對后續(xù)純化的影響 ? 大多數(shù)蛋白將帶負(fù)電荷，樣品會含一定量核酸； ? （ NH4） 2SO4 沉淀，通常蛋白濃度 1５ mg/ml ； ? 運行層析，則蛋白濃度不應(yīng)大于１０mg/ml。 通常純化流程：選擇性、分辨率、載量 ?目標(biāo)蛋白為堿性蛋白，在中性附近運用陽離子交換，選擇性好，除核酸 多糖； ?目標(biāo)蛋白為酸性蛋白，則第一步層析采用分子篩，最好此前將溶液脫鹽，并在含０ .２ ０ .４ M NaCl的緩沖液中運行，緩沖成分視下一步而定。如果介質(zhì)含聚丙烯酰胺，則應(yīng)含 Tris 等含氮的緩沖成分，減少 ??互相作用造成的吸附 . ?離子交換后，采用疏水層析，可省去緩沖液交換步驟（ Buffer Exchange）； ?如有必要，濃縮后， Buffer Exchange，進(jìn)行精制。 ?離子交換：平衡液應(yīng)采用盡量低的離子強度，上樣體積不限。 ?pH：陽離子通常低于 pI 一個 pH單位 陰離子通常高于 pI 一個 pH單位 ?Sticky protein：在某 pH附近，與陽離子和陰離子層析介質(zhì)都結(jié)合。 ?參數(shù)獲得 ?２ .５％上樣體積運行離子交換及疏水，樣品不需平衡。 實例及分析 ? 從陽離子交換入手 ── 凝膠過濾，疏水 ? 從凝膠過濾入手 ── 疏水，離子交換 ? 親和層析不一定必要 從凝膠過濾入手 ── 離子交換 ?hpag4蛋白分子量約 180kD， pI約 5，粗提物中含量約 5%； ?粗提物主要特性： I約 ； pH約 ；蛋