【文章內(nèi)容簡介】 12期 姚利曉等：應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)從枳中篩選根特異表達基因 2485 達分析結(jié)果豐富了CFGP的數(shù)據(jù)。 Table 2 表2 部分Unigenes定量PCR結(jié)果 The real time PCR result of partial Unigenes ESTs數(shù) rent tissues in CFGP CFGP中不同組織來源EST numbers from diffe基因 Unigene 注釋 Nr_annotation ne 果實 Fruit 根中相對表達倍數(shù)（葉為1） Relative fold 根 葉 離層 Root Leaf Abscission zoexpression in root contig 1 白 DNA binding protein DNA結(jié)合蛋16 0 0 1 contig 8 抗酒石酸酸性磷酸酶 Tartrateresistant acid phosphatase type 5 otein contig 22 6 0 0 0 contig 28 ng protein 3 0 0 0 contig 38* 0 0 0 0 ck protein cid oxidase singleton 52 ase 1 0 0 0 singleton 60 e P450 2 0 1 1 e protein amily protein singleton 169 1 0 1 1 protein singleton 265* ette 0 0 0 0 rotein 213 1 1 1 contig 12 衰老相關(guān)蛋白 Senesenceassociated pr2 0 0 1 主要乳液蛋白 Major latex protein 藍銅結(jié)合蛋白 Blue copperbindi未知蛋白 Unknowncontig 54 熱休克蛋白 Calmodulinbinding heatsho1 0 0 0 contig 56 貝殼杉烯酸氧化酶 entkaurenoic a1 0 0 1 貝殼杉烯酸氧化酶 entkaurenoic acid oxid細胞色素P450 Cytochromsingleton 73 低溫誘導(dǎo)蛋白 Low temprature inducedlik9 4 0 4 singleton 86* bet v I家族蛋白 bet v I allergen f0 0 0 0 細胞色素P450 Cytochrome P450 singleton 247 1433蛋白 14334 1 2 0 ATP結(jié)合盒 ATPbinding casssingleton 283 甲基轉(zhuǎn)移酶 Omethyltransferase 1 8 1 1 5 singleton 297 主要乳液蛋白 Major latex p0 0 1 1 * 隨機選擇。 electio3 通過構(gòu)建枳根的消減文庫，并進一步應(yīng)用定量PCR分析，得到在根中高表達的基因，要乳液蛋白基因contig 2藍銅結(jié)合蛋白基因contig 2貝殼衫烯酸氧化酶基因contig 56和singl植物，如擬南芥、煙草、甜椒、桃、樹莓、草莓、甜瓜、黃瓜和大豆中也分離出主要* Random sn. 討論 本研究中如主eton 52等。 主要乳液蛋白最先在罌粟的乳液中發(fā)現(xiàn)（Nessler et al.，1985），因是罌粟乳液中的主要蛋白而得名。隨后在其它乳液蛋白基因。隨著植物基因組學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)植物主要乳液蛋白基因包含不同的家族成員。有研究顯示主要乳液蛋白與植物發(fā)育相關(guān)，在花、果實或根中特異表達，受順式肉桂酸、乙烯的誘導(dǎo)（Aggelis et al.，1997；Kloos et al.，2002；Ruperti et al.，2002；Dowd et al.，2004；Wu et al.，2008；Guo et al.，2011）。主要乳液蛋白參與植物對生物或非生物逆境的防御反應(yīng)，在高鹽、低溫、干旱、強光和黑暗等非生物逆境下，其表達量在短期內(nèi)迅速提高（Nam et al.，2003；Hwang et al.，2004；Kimbrough et al.，2004；Chen amp。 Dai，2010；Sun et al.，2010）；在病原物誘導(dǎo)下主要乳液蛋白基因的表達增強，與植物的抗病性相關(guān)（Chen amp。 Dai，2010）。本研究中在枳根消減文庫中篩選出主要乳 2486 園 藝 學(xué) 報 41卷 液蛋白基因，其在根中的表達量是葉中的46倍，表明該基因可能在根中特異性高表達。 藍銅結(jié)合蛋白是一種廣泛存在于微生物和植物中的古老超蛋白家族，能結(jié)合Ⅰ型銅離子。植物藍銅結(jié)合蛋白超家族由質(zhì)體蘭素和 Phytocyanins（PCs）兩個蛋白家族組成，它們間氨基酸序列相似性 et al.，2001）。貝殼杉烯，也可為下一步根特異性啟動子的克隆提供參考。 AggelA，John I，Karvouni Z，Grierson D. 1997. Characterization of two cDNA clones for mRNAs expressed during ripening of melon（Cucumis . Plant Molecular Biology，33：313–322. gene family in Upland cotton（Gossypium hirsutum L.）. Theoretical and Applied Chen873. um f. sp. vasinfectum. Molecular PlantMicrobe Interactions，17：654–667. gene sequence. Plant Molecular Biology，75：Guo ular Biology，75：481–495. 較低（小于20%），但該超家族蛋白均含有1個二硫鍵，能夠形成8個β–折疊結(jié)構(gòu)。PCs蛋白家族分為4個亞家族：漆樹藍蛋白（Stellacyanins）、質(zhì)體蘭素（Plantacyanins）、花青苷（Uclacyanins） 和早期結(jié)瘤素樣蛋白（early nodulinlike proteins，ENODLs）。目前已從大白菜、水稻等植物的基因組中分別鑒別出84個和62個PCs編碼基因（Ma et al.，2011；Li et al.，2013）。PCs在植物的抗逆過程中具有重要作用，參與非生物脅迫，如干旱、鹽害、低溫、金屬離子等的反應(yīng)過程（Ruan et al.，2011；Wu et al.，2011）。但藍銅結(jié)合蛋白的功能特別是早期結(jié)瘤素樣蛋白的功能研究甚少，本研究中發(fā)現(xiàn)的contig 28編碼早期結(jié)瘤素樣蛋白，尚未在柑橘中發(fā)現(xiàn)相關(guān)的報道。 貝殼杉烯酸氧化酶屬于細胞色素P450（CYP450）蛋白家族中的CYP88A亞家族，是赤霉素合成過程中的一個關(guān)鍵酶，催化貝殼衫烯酸到GA12的三步反應(yīng)過程（Helliwell酸氧化酶的研究多限于突變體，玉米dwarf3基因是該亞家族第1個被克隆的基因（Winkler amp。 Helentjaris，1995），隨后從擬南芥、大麥和豌豆中也克隆出該基因（Helliwell et al.，2001；Davidson et al.，2003）。不僅貝殼杉烯酸氧化酶基因核苷酸序列的突變會造成植株的矮化，最近研究發(fā)現(xiàn)貝殼杉烯酸氧化酶表達水平的變化也會對植物的株形造成影響，形成矮化變異株（歐春青 等，2013）或影響花序的發(fā)育（Guo et al.，2012）。貝殼杉烯酸氧化酶基因在植物不同組織和不同發(fā)育階段表達，目前發(fā)現(xiàn)向日葵貝殼杉烯酸氧化酶基因HaKAO2主要在根中表達（Fambrini et al.，2011）。本研究中也發(fā)現(xiàn)兩個在枳根中高表達的貝殼杉烯酸氧化酶基因singleton 52和contig 56，其在根中的表達量分別是葉中的130和11倍，同時在根的消減文庫中也發(fā)現(xiàn)其它的P450蛋白，但其組織表達特性尚未進行深入研究。 本研究中通過構(gòu)建枳根的消減文庫，發(fā)現(xiàn)大量根中高表達基因，這不僅為柑橘基因工程育種豐富了候選的外源功能基因 References is melo L.）fruitsBuriev Z T，Saha S，Abdurakhmonov I Y，Jenkins J N，Abdukarimov A，Scheffler B E，Stelly D M. 2010. Clustering，haplotype diversity and locations of MIC3：A unique rootspecific defenserelated Genetics，120：587–606. J Y，Dai X F. 2010. Cloning and characterization of the Gossypium hirsutum major latex protein gene and functional analysis in Arabidopsis thaliana. Planta，231：861–Davidson S E，Elliott R C，Helliwell C A，Poole A T，Reid J B. 2003. The pea gene NA encodes entkaurenoic acid oxidase. Plant Physiology，131：335–344. Dowd C，Wilson L W，McFadden H. 2004. Gene expression profile changes in cotton