外源基因在酵母中的表達(編輯修改稿)
2025-02-14 17:08 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 UAS GAL4 GAL80 半乳糖誘導時， GAL4高效表達， GAL GAL GAL10超高效表達 GAL10 Promoter 的半乳糖 利用酶系 由 G A L 1 G A L 7和 G A L 10 基因編碼 外源基因在酵母中表達的限制因素 外源基因穩(wěn)態(tài) mRNA的濃度 外源基因 mRNA的翻譯活性 酵母菌對密碼子的偏愛性 在釀酒酵母中 ， 高豐度的蛋白質(zhì) （ 如甘油醛 3磷酸脫氫酶 GAPDH、 磷酸甘油激酶 PKG、 乙醇脫氫酶 ADH） 中 96% 以上的氨基酸是由 25個密碼子編碼的。 酵母表達系統(tǒng)的選擇 釀酒酵母的基因表達系統(tǒng)最為成熟，包括轉(zhuǎn)錄活性較高的甘油 醛 3磷酸脫氫酶基因 GAPDH、 磷酸甘油激酶基因 PKG、 乙醇脫氫 釀酒酵母表達系統(tǒng) 酶基因 ADH所屬的啟動子，多種重組外源蛋白獲得成功表達。 釀酒酵母表達系統(tǒng)的最大問題在于其 超糖基化 能力，往往使得 有些重組蛋白（如人血清白蛋白等）與受體細胞緊密結(jié)合，而不能 大量分泌。這一缺陷可用非釀酒酵母型的表達系統(tǒng)來彌補。 酵母表達系統(tǒng)的選擇 乳酸克魯維酵母的雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒 pKD1已被廣泛用作重組異源 蛋白生產(chǎn)的高效表達穩(wěn)定性載體 ， 即便在無選擇壓力的條件下 ， 也 乳酸克魯維酵母表達系統(tǒng) 能穩(wěn)定遺傳 40代以上。 乳酸克魯維酵母表達分泌型和非分泌型的重組蛋白 ， 性能均優(yōu) 于釀酒酵母表達系統(tǒng)。 酵母表達系統(tǒng)的選擇 巴斯德畢赤酵母是一種 甲基營養(yǎng)菌 ， 能在低廉的含甲醇培養(yǎng)基中生 巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng) 長 ， 甲醇 可高效誘導甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達 ， 因此生長迅 速 、 乙醇氧化酶基因 AOX1所屬強啟動子 、 表達的可誘導性是巴斯德畢 赤酵母表達系統(tǒng)的三大優(yōu)勢。但甲醇 易揮發(fā) ，操作條件差。 由于巴斯德畢赤酵母沒有合適的自主復制型載體 ， 所以外源基因的 表達序列一般 整合 入受體的染色體 DNA上 。 在此情況下 ， 外源基因的 有經(jīng)濟價值的重組蛋白在巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)中獲得成功表達。 高效表達在很大程度上取決于整合 拷貝數(shù) 的多寡 。 目前已有 50余種具 酵母表達系統(tǒng)的選擇 多型漢遜酵母也是一種 甲基營養(yǎng)菌 。 其自主復制序列 HARS已被克 多型漢遜酵母表達系統(tǒng) 隆 ， 并用于構(gòu)建克隆表達載體 ， 但與巴斯德畢赤酵母相似 ， 這種載體在 受體細胞有絲分裂時顯示出不穩(wěn)定性 。 所不同的是 ， HARS質(zhì)粒 能高頻 自發(fā)地整合在受體的染色體 DNA上 ， 甚至可以連續(xù)整合 100多個拷貝 ， 目前 ， 包括乙型肝炎表面抗原在內(nèi)的數(shù)種外源蛋白在該系統(tǒng)中獲得 因此重組多型漢遜酵母的構(gòu)建也是采取整合的策略。 成功表達。 F 利用重組 酵母生產(chǎn)乙肝疫苗 6 外源基因在酵母中的表達 由 乙型肝炎病毒 （ HBV） 感染引起的急慢性乙型肝炎是一種嚴重 的傳染病 ， 每年約有 200萬 病人死亡 ， 并有 3億 人成為 HBV攜帶者 ， 其 中相當一部分人可能轉(zhuǎn)化為肝硬化或肝癌患者 。 目前對乙型肝炎病毒 還沒有一種有效的治療藥物 ， 因此高純度乙型疫苗的生產(chǎn)對預防病毒 感染具有重大的社會效益 ， 而利用重組酵母大規(guī)模生產(chǎn)乙型疫苗為其 廣泛應用提供了可靠的保證。 乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 乙肝病毒 是一種蛋白包裹型的 雙鏈 DNA病毒 ， 具有感染力的病毒顆 乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu) 粒呈球面狀 ， 直徑為 42 nm， 基因組僅為 kb。 病毒顆粒的主要結(jié)構(gòu) 蛋白是病毒的 表面抗原多肽 （ HBsAg） 或 S多肽 ， 它具有糖基化和非糖 基化兩種形式 。 顆粒內(nèi)的蛋白成份包括 核心抗原 （ HBcAg） 、 病毒 DNA 除此之外 ， 被乙肝病毒感染的人的肝臟還能合成并釋放大量的 22 聚合酶、微量病毒蛋白。 nm的空殼亞病毒顆粒 ， 其免疫原性是未裝配的各種包裝蛋白組份的 1000倍。包裝蛋白共有三種轉(zhuǎn)膜糖蛋白： S、 M、 L多肽。 乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 乙型肝炎病毒的包裝蛋白編碼基因 ATG ATG ATG TAA 108 aa 55 aa 226 aa preS1 preS2 S S 多肽 226 aa M 多肽 281 aa L 多肽 399 aa 乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 乙肝病毒在體外細胞培養(yǎng)基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫 傳統(tǒng)乙肝疫苗的制備 苗是從病毒攜帶者的肝細胞質(zhì)膜上提取出來的。雖然這種質(zhì)膜來源的 疫苗具有較高的免疫原性，但由于原材料的限制難以大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。 產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒酵母 20世紀 80年代開始選擇 釀酒酵母 表達重組 HBsAg， 主要工作包括 將 S多肽的編碼置于 ADH1啟動子控制下 ， 轉(zhuǎn)化子能表達出具有免疫活 性的重組蛋白 ， 它在細胞提取物中以球形脂蛋白顆粒的形式存在 ， 平 均顆粒直徑為 22nm， 其結(jié)構(gòu)和形態(tài)均與慢性乙肝病毒攜帶者血清中 的病毒顆粒相同。 目前 ， 由釀酒酵母生產(chǎn)的重組 HBsAg顆粒已作為乙肝疫苗商品化 重組產(chǎn)物的最終產(chǎn)量可達細胞總蛋白量的 1%2%。 進一步的研究表明 ， M多肽和 L多肽對 S型疫苗具有顯著的增效作 用 ， 由三者 （ 或兩者 ） 構(gòu)成的復合型乙肝疫苗還可以誘導那些對 S抗 原缺乏響應的人群的免疫反應。 產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母 整合型重組巴斯德畢赤酵母的構(gòu)建 PARS2 Bgl II 5’ AOX1 HBsAg PHIS4 3’ AOX1 Bgl II pBSAG151 11 kb Bgl II 5’ AOX1 HBsAg PHIS
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