原位雜交技術(shù)原理及其應(yīng)用(編輯修改稿)
2025-06-17 17:52 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 消化后，應(yīng)用 （在 PBS中）清洗以終止蛋白酶 K的消化作用，甘氨酸是蛋白酶 K的抑制劑。為保持組織結(jié)構(gòu)，通常用 4%多聚甲醛再固定。 ? Burns等（ 1987）報(bào)告應(yīng)用 胃蛋白酶 （ Pepsin）20～ 100μg/ml （用 HCl 配） 37℃ 、 30min進(jìn)行消化，所獲實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)于蛋白酶 K。 ? 多聚甲醛固定后，浸入 乙酸酐 （ acetic anhydride）和 三乙醇胺 （ tri－ethanolamine）中以減低靜電效應(yīng)，減少探針對(duì)組織的非特異性背景染色。 ? 有的作者除在室溫下浸于上述溶液 10min外，還在預(yù)熱 37℃ 的 50%甲酰胺 /2 SSC液 中預(yù)雜交 15min，然后用 2 SSC， NaAc/。 ? 但也有報(bào)道乙酸酐和三乙醇胺液的處理并不能起到減低背景的目的，不能改善 ISHH的信 /噪比例。 3．減低背景染色 雜交后（ Posthybridization）的酶處理和雜交后的洗滌均有助于減低背景染色。 ? 預(yù)雜交（ Prehybridization）是減低背景染色的一種有效手段。預(yù)雜交液和雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖（ Dextran sulphate）。將組織切片浸入預(yù)雜交液中可達(dá)到封閉非特異性雜交點(diǎn)的目的，從而減低背景染色。 4．防止 RNA酶的 污染 由于在手指皮膚及實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿上均可能含有 RNA酶，為防止其污染影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在整個(gè)雜交前處理過(guò)程都需戴消毒手套。所有實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿及鑷子都應(yīng)于實(shí)驗(yàn)前一日置高溫（ 240℃ ）烘烤以達(dá)到消除 RNA酶的目的。 要破壞 RNA酶，其最低溫度必須在 150℃ 左右。雜交前及雜交時(shí)所應(yīng)用的溶液均需經(jīng)高壓消毒處理。 （三）雜交 （ Hybridisation） ? 雜交是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片。加蓋片的目的是防止孵育過(guò)程中的高溫（ 50℃ 左右）導(dǎo)致雜交液的蒸發(fā)。硅化的蓋玻片的優(yōu)點(diǎn)是清潔無(wú)雜質(zhì)，光滑不會(huì)產(chǎn)生氣泡和影響組織切片與雜交液的接觸，蓋玻片自身有一定重量能與有限的雜交液吸附達(dá)到覆蓋和防止蒸發(fā)的作用。為保證雜交所需的濕潤(rùn)環(huán)境，放在濕盒中進(jìn)行孵育。 ? 注意事項(xiàng) 1． 探針的濃度 很難事先確定，但要掌握一個(gè)原則，即探針濃度必須給予該實(shí)驗(yàn)最大的信 /噪比值。 ? 非放射性標(biāo)記（生物素或地高辛）探針濃度為 ～ （即 ～ ）。放射性標(biāo)記的 dsDNA或 cRNA探針濃度在 2～ 5ng/μl 。 ? 必須強(qiáng)調(diào)的是，加雜交液的量要適當(dāng)，以10～ 20μl/ 每張切片為宜。雜交液過(guò)多不僅造成浪費(fèi)，而且液量過(guò)多常易致蓋玻片滑動(dòng)脫落，影響雜交效果，過(guò)量的雜交液含核酸探針濃度過(guò)高，反易導(dǎo)致高背景染色等不良后果。 ?2． 探針的長(zhǎng)度 ? 一般應(yīng)用于 ISHH探針的最佳長(zhǎng)度應(yīng)在 50～ 100個(gè)堿基之間。探針短易進(jìn)入細(xì)胞，雜交率高，雜交時(shí)間短。 ? 3．雜交的 溫度和時(shí)間 ? 原位雜交中，多數(shù) DNA探針需要的 Tm是 90℃ ，而 RNA則需要 95℃ 。 ? 在雜交的程序中常規(guī)的加入 30%～ 50%甲酰胺（ for－ mamide）于雜交液中。反應(yīng)液中每增加 1%的甲酰胺濃度， Tm值可降低 ℃ 。 ? 可用調(diào)節(jié)鹽濃度的辦法來(lái)調(diào)節(jié) Tm。 ? 由于鹽和甲酰胺濃度的調(diào)節(jié)等因素，實(shí)際采用的原位雜交的溫度在 Tm25℃ 左右，即比 Tm減低 25℃ ，大約在 30～ 60℃ 之間 ? 根據(jù)探針的種類不同，溫度略有差異， RNA和 cRNA探針一般在 37～ 42℃ 左右，而 DNA探針或細(xì)胞內(nèi)靶核苷酸為 DNA的，則必須在 80～ 95℃ 加熱使其變性，時(shí)間 5～ 15min，然后在冰上擱置 1min，使之迅速冷卻，以防復(fù)性，再置入盛有 2 SSC的溫盒內(nèi)，在37～ 42℃ 孵育雜交過(guò)夜。 ? 從理論上講，核苷酸雜交的有效反應(yīng)時(shí)間在 3h左右。但為穩(wěn)妥起見(jiàn)，一般將雜交反應(yīng)時(shí)間定為 16～ 20h。當(dāng)然，雜交反應(yīng)的時(shí)間與核酸探針長(zhǎng)度與組織通透性有關(guān)。 ? 有作者主張雜交反應(yīng)的孵育應(yīng)在黑暗環(huán)境中進(jìn)行，因?yàn)楣饩€會(huì)促進(jìn)甲酰胺的電離作用。 ? 4．雜交嚴(yán)格度（ Hybridization stringency） ? 雜交條件的嚴(yán)格度（ stringency）表示通過(guò)雜交及沖洗條件的選擇對(duì)完全配對(duì)及不完全配對(duì)雜交體的鑒別程度。錯(cuò)配對(duì) (mismatch）雜交的穩(wěn)定性較完全配對(duì)雜交體差，因此，通過(guò)控制雜交溫度、鹽濃度等，可減弱非特異性雜交體的形成，提高雜交的特異性。 ? 雜交的條件愈高，特異性愈強(qiáng)，但敏感性降低。一般來(lái)說(shuō)， 低嚴(yán)格度 （ low stringency）雜交及沖洗條件在 Tm 35℃ 至 Tm –40℃ 之間，高鹽或低甲酰胺濃度。在這種條件下，大約有 70%～ 90%的同源性核苷酸序列被結(jié)合，其結(jié)果是導(dǎo)致非特異性雜交信號(hào)的產(chǎn)生。 中嚴(yán)格度 ， Tm 20℃ 至 Tm30℃ 的范圍。高嚴(yán)格度 （ high stringency）為 Tm10℃ 至 Tm15℃ ，低鹽和高甲酰胺濃度。在這種條件下，只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成穩(wěn)定的結(jié)合。 ? 由于原位雜交技術(shù)多數(shù)是在 Tm25℃ 進(jìn)行的，不屬于高嚴(yán)格范圍，無(wú)疑會(huì)產(chǎn)生非特異性結(jié)合導(dǎo)致信 /噪比減低。在這種情況下，可用加強(qiáng)雜交后處理洗滌的嚴(yán)格度使非特異性的雜交體減少。由于 RNA雜交的穩(wěn)定性，應(yīng)用 cRNA探針進(jìn)行細(xì)胞或組織的原位雜交時(shí)的雜交溫度比其它核酸探針要高 10～ 15℃ 。實(shí)驗(yàn)證明， cRNA產(chǎn)生的信號(hào)比雙鏈 cDNA要強(qiáng)。單鏈的 RNA探針其雜交
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