【文章內(nèi)容簡介】 列稱為表達(dá)序列標(biāo)簽，一般長 300500bp左右。 ? 目標(biāo) ：鑒別全部基因，包括 RNA基因，以及基因組中其它序列的結(jié)構(gòu)和功能。 ?轉(zhuǎn)錄圖或基因表達(dá)譜研究所提供的信息，使人們有可能系統(tǒng)、全面地從 mRNA水平了解特定細(xì)胞 人類基因組計(jì)劃 （ human genome project， HGP） ? 人類基因組即人類一個(gè)細(xì)胞所包含的DNA結(jié)構(gòu)一整套基因，攜帶決定生物特性的全部遺傳信息 ——即記錄基因組全部 DNA序列。 ? “ 逐個(gè)克隆法 ”：對連續(xù)克隆系中排定的BAC 克隆逐個(gè)進(jìn)行亞克隆測序并進(jìn)行組裝( 公共領(lǐng)域測序計(jì)劃 ) ? “ 全基因組鳥槍法 ”： 在一定作圖信息基礎(chǔ)上，繞過大片段連續(xù)克隆系的構(gòu)建而直接將基因組分解成小片段隨機(jī)測序，利用超級計(jì)算機(jī)進(jìn)行組裝 ( 美國 Celera公司） 人類基因組計(jì)劃：大規(guī)模測序基本策略 基本原理 : 通過合成與單鏈 DNA互補(bǔ)的多核苷酸鏈，由于合成的互補(bǔ)鏈可在不同位置隨機(jī)終止反應(yīng)，產(chǎn)生只差一個(gè)核苷酸的 DNA分子，從而來讀取待測 DNA分子的順序。 鏈終止法測序 (the chain termination method) Sanger 基因文庫 ? 基因文庫 (G文庫 )：是含有某種生物全部基因隨機(jī)片段的重組 DNA克隆群。 ? 基因文庫含有基因組內(nèi) 全部基因 片段，包括外顯子和無表達(dá)功能的內(nèi)含子序列。 ? 每一個(gè)克隆只含有一個(gè)基因片段，應(yīng)用時(shí)利用探針，從文庫中釣取含有所需目的基因的克隆。 cDNA文庫 ? cDNA文庫 (C文庫 ) ：是以 mRNA互補(bǔ)合成的cDNA的隨機(jī)片段的重組 DNA克隆群。 ? cDNA文庫 不含內(nèi)含子序列 ，易于表達(dá)。 ? 具有 組織細(xì)胞特異性 ：不同組織細(xì)胞、不同發(fā)育階段，基因表達(dá)的情況都不相同，應(yīng)選擇特異表達(dá)的細(xì)胞及狀態(tài)； ? C文庫比 G文庫小得多，更容易篩選。 后基因組研究計(jì)劃 ? “功能基因組學(xué)” 是研究基因組中所有基因功能的學(xué)科。它在整體水平上研究一種組織或細(xì)胞在同一時(shí)間或同一條件下所表達(dá)的基因的種類、數(shù)量、功能及在基因組中的定位，或同一細(xì)胞在不同狀態(tài)下基因表達(dá)的差異。 ? 主要內(nèi)容 ? 基因表達(dá)譜的研究 ? 蛋白質(zhì)產(chǎn)物的功能 ? 基因組多樣性的研究 ? 基因組功能注釋 轉(zhuǎn)座子 ? 轉(zhuǎn)座子 （ transposon， Tn） ?基因組中存在的能自主復(fù)制和位移的一些 DNA序列。 ? 轉(zhuǎn)座子的共同特點(diǎn) ?兩端有反向重復(fù)序列（ inverted terminal repeats，ITR， IR）； ?轉(zhuǎn)座后靶位點(diǎn)重復(fù)序列是正向重復(fù)（ direct repeats， DR）； ?編碼與轉(zhuǎn)座有關(guān)的蛋白，例如轉(zhuǎn)座酶； ?可以在基因組中移動(dòng)； ? 轉(zhuǎn)座子是基因組的正常組成成分， 不以獨(dú)立的形式存在 （如噬菌體或質(zhì)粒 DNA）。轉(zhuǎn)座的發(fā)生 不依賴于轉(zhuǎn)座子和靶位點(diǎn)之間任何的序列同源性 ，在基因組內(nèi)由一個(gè)部位直接轉(zhuǎn)移到另一個(gè)部位。 ? 轉(zhuǎn)座以 很低的頻率 發(fā)生，而且轉(zhuǎn)座子的插入是 隨機(jī) 的， 轉(zhuǎn)座子分類 ? 按照作用過程分類 ?轉(zhuǎn)座子 直接以 DNA形式介導(dǎo)，遺傳信息的移動(dòng)是從 DNA到 DNA。 ?逆轉(zhuǎn)座子（返座子） 由 RNA介導(dǎo)，即遺傳信息的移動(dòng)是從 DNA到 RNA再到 DNA。 ? 按照結(jié)構(gòu)分類 ?簡單型轉(zhuǎn)座子 ?復(fù)合型轉(zhuǎn)座子 ?轉(zhuǎn)座子 A家族 ?轉(zhuǎn)座噬菌體 ? 簡單型轉(zhuǎn)座子 不含任何宿主基因，常被稱為插入序列（ insertional sequence）即 IS序列 ，是可獨(dú)立存在的單元，帶有介導(dǎo)自身移動(dòng)的蛋白。 ? 復(fù)合型轉(zhuǎn)座子 帶有某些宿主基因（如抗藥性基因），其兩翼往往是兩個(gè)相同或高度同源的 IS序列。 轉(zhuǎn)座子 A家族 ? TnA家族包括幾個(gè)相關(guān)的轉(zhuǎn)座子，其中 Tn3和Tn1000最具代表性 ? 結(jié)構(gòu)特點(diǎn) ?比較大 —— 5kb， ?兩端不含 IS，通常末端有 38bp左右的 IR， ?具有獨(dú)立的轉(zhuǎn)座酶和解離酶基因，含抗藥性基因 ? 基因組靶位點(diǎn)的交錯(cuò)斷裂； ? 轉(zhuǎn)座子連接到單鏈末端，填補(bǔ)缺口； ? 靶位點(diǎn)不具有特異性，但也有插入熱點(diǎn)區(qū)域存在。 轉(zhuǎn)座機(jī)制的共同特征 轉(zhuǎn)座子產(chǎn)生的復(fù)制或非復(fù)制類型 ? 復(fù)制型轉(zhuǎn)座 ? 非復(fù)制型轉(zhuǎn)座 ? 保守型轉(zhuǎn)座 逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的結(jié)構(gòu)與功能 編碼區(qū)： 典型的反轉(zhuǎn)錄病毒含 3—4個(gè)“基因” ? gag: internal structural protein 病毒核心蛋白基因 ? pol: RNA－ dependent DNA polymerase 逆轉(zhuǎn)錄酶基因 ? env: envelop glycoproteins 外膜糖蛋白基因 非編碼區(qū) ? R區(qū) ：為基因組兩端的重復(fù)序列，每個(gè)重復(fù)單位10－ 80nt， cDNA(—)的反轉(zhuǎn)錄所必需的。 ? PB177。 : 負(fù)鏈 cDNA合成的起始位點(diǎn)，稱為引物結(jié)合區(qū)可與各種 tRNA的 3?端堿基互補(bǔ) ? U區(qū) ?U5 80100nt(單一序列 ) ?U3 含 170－ 1260（或 1350） nt，含有強(qiáng)的啟動(dòng)子，從這里開始合成前病毒 DNA 質(zhì)粒的 遺傳 特性 ? 雙鏈閉合環(huán)狀 DNA（ cccDNA）， 1～ 200kb； ? 質(zhì)粒復(fù)制有賴于宿主細(xì)胞的復(fù)制，但其自身基因可控制合成的時(shí)限及拷貝數(shù)； ? 垂直傳遞； ? 不影響宿主細(xì)胞的代謝，但可能賦予宿主細(xì)胞新的表型； ? 質(zhì)粒的復(fù)制方式 半保留復(fù)制；單向 /雙向；單向；雙向； 質(zhì)粒的遺傳學(xué)類型 ? F質(zhì)粒 性質(zhì)粒。 ? R質(zhì)粒 耐藥性質(zhì)粒。 ? Col質(zhì)粒 含有合成大腸桿菌素基因的質(zhì)粒； ? 質(zhì)粒噬菌體 由質(zhì)粒 DNA和噬菌體 DNA重組形成的嵌合體。 根據(jù)復(fù)制特點(diǎn)，質(zhì)粒分類 ? 嚴(yán)緊型質(zhì)粒（ stringennt plasmid） ?其 DNA復(fù)制與宿主染色體 DNA的復(fù)制相偶聯(lián)，依賴于蛋白質(zhì)的合成，復(fù)制要求 DNA聚合酶 Ⅲ 的存在； ? 松弛型質(zhì)粒（ relax plasmid） ?其 DNA復(fù)制與宿主染色體 DNA的復(fù)制不同步，且與蛋白質(zhì)的合成功能無關(guān)；用 DNA聚合酶 Ⅰ 復(fù)制，能在沒有蛋白質(zhì)合成的情況下繼續(xù)復(fù)制； ? 低拷貝質(zhì)粒與高拷貝質(zhì)粒 質(zhì)粒的不相容性 ? 質(zhì)粒的不相容性 指 兩種親緣關(guān)系相近的質(zhì)粒不能穩(wěn)定地存在于同一個(gè)細(xì)胞中。 ? 不相容性是由于兩種質(zhì)粒中具有類似的阻遏物及質(zhì)粒 DNA隨機(jī)復(fù)制而導(dǎo)致的結(jié)果。 ? 接合型質(zhì)粒 ?質(zhì)粒 DNA中帶有編碼細(xì)菌配對和質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的基因，可從一個(gè)細(xì)胞傳遞給另一個(gè)細(xì)胞；一般其分子量較大，多為嚴(yán)密型質(zhì)粒。 ? 非接合型質(zhì)粒 ?不能在細(xì)胞間水平傳播，但可以借助共同存在于宿主細(xì)胞中的接合型質(zhì)粒，而發(fā)生遷移作用；一般其分子量較小，多為松弛型質(zhì)粒。 ? 基因工程中，通常采用的是松弛型、非接合型質(zhì)粒。 ? 廣義的遺傳重組 ?凡是能產(chǎn)生新的基因組合，造成基因型變化的過程，都稱為遺傳重組。 ?包括獨(dú)立分配或交換；如減數(shù)分裂中的非同源染色體的自由組合。 ? 狹義的遺傳重組 ?專指涉及 DNA分子內(nèi)的斷裂并重新連接而造成基因重新組合的過程，即基因交換。 遺傳重組的類型 ? 同源重組 ? 位點(diǎn)特異性重組 ? 轉(zhuǎn)座作用 ? 異常重組 同源重組 ? 同源重組 是 依賴大范圍的 DNA同源序列 的聯(lián)會(huì)。重組過程中，兩個(gè)染色單體或 DNA分子相互交換對等的部分，因此表現(xiàn)出交互的特點(diǎn)。 ? 同源重組中負(fù)責(zé) DNA配對和重組的蛋白質(zhì)系統(tǒng) 無堿基序列的特異性的要求 ，只要兩條 DNA序列表現(xiàn)出同源性 (相同或接近 )，重組就可以在此序列中的任何一點(diǎn)發(fā)生。 ? 重組熱點(diǎn) :一些序列發(fā)生重組的頻率高于其他序列 同源重組的分子機(jī)制 （ Holliday模型 ） 四個(gè)關(guān)鍵步驟 ? 兩個(gè)同源染色體 DNA排列整齊； ? 一個(gè) DNA的一條鏈斷裂并與另一個(gè) DNA對應(yīng)的鏈連接，形成的連接分子稱為 Holliday中間體； ? 通過分支移動(dòng)產(chǎn)生異源雙鏈 DNA； ? Holliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈重組體 DNA。 位點(diǎn)專一性重組 ? att位點(diǎn)為 ?POP?(240bp) ?BOB?(23bp) ? 整合過程需要 ?λ整合酶 （ Int） ?寄主的整合宿主因子 IHF λ噬菌體的整合作用 ? 裂解期和溶源化的 λDNA可以通過位點(diǎn)特異性重組相互轉(zhuǎn)變（整合和切離）； ? λ噬菌體和宿主均有相應(yīng)的 附著點(diǎn) att，噬菌體 DNA位點(diǎn)稱為 attP，宿主 DNA位點(diǎn)稱為 attB。 ? 其中 O序列 在二者之間同源，是二者配對及發(fā)生互換的區(qū)域。 O序列全長 15bp，富含 AT堿基對，無回文序列。 組成 核心序列 左翼序列 右翼序列 attP POP? O P P? attB BOB? O B B? 免疫球蛋白基因 ? 屬于 3個(gè)基因家族，分別位于不同的染色體上 ?兩個(gè)輕鏈類型（ Igκ、Igλ基因） ?一個(gè)重鏈類型（ IgH基因） 抗體多樣性產(chǎn)生的原因 ? 通過從不同的基因片段中隨機(jī)選擇幾個(gè)基因片段組合成不同的抗體。 ? V（ D） J重排是不精確的，可在連接位置兩端的任何一端刪除一些堿基或加上原來片段中沒有的堿基。 ? 體細(xì)胞突變，當(dāng)一個(gè)產(chǎn)生抗體的細(xì)胞克隆增殖時(shí)，正好遇到外來抗原，將產(chǎn)生抗體基因的突變。 重組信號和 12/23規(guī)則 ? 每個(gè)基因旁都有一個(gè)保守的回文結(jié)構(gòu) ——七聚體 5?CACAGTG3?；其旁是保守的 九聚體 5?ACAAAAACC3?。 ? 重排信號序列 （ rebination signal sequences，RSSs）：指七聚體和九聚體之間的 12個(gè)堿基或 23個(gè)堿基序列。 ? 12/23規(guī)則保證輕鏈和重鏈的正確連接。 ?12/23規(guī)則 即重排信號序列的排列規(guī)則是 12bp的信號序列總是與 23bp個(gè)堿基的信號序列連接。 復(fù)制的忠實(shí)性 DNA復(fù)制過程是一個(gè)高度精確的過程，據(jù)估計(jì)，大腸桿菌 DNA復(fù)制 5?109堿基對僅出現(xiàn)一個(gè)誤差，保證復(fù)制忠實(shí)性的原因主要有以下三點(diǎn) : ? DNA聚合酶的高度專一性 （嚴(yán)格遵循堿基配對原則，錯(cuò)配率為 7 ?106 ） ? DNA聚合酶的校對功能 （錯(cuò)配堿基被 3?5?外切酶切除） ? 起始時(shí)以 RNA作為引物 DNA復(fù)制的酶系 ? 解鏈有關(guān)的酶 ? DNA聚合酶類（ DNA polymerase） ? 引發(fā)酶 ? DNA連接酶 解旋酶 DNA聚合酶 III 解鏈酶 RNA引物 引物酶和引發(fā)體 DNA聚合酶 I SSB 3180。 3180。 5180。 3180。 5180。 5180。 RNA引物 解鏈有關(guān)的酶 ? 解鏈酶 ?解開 DNA雙鏈中氫鍵，消耗 ATP ?解旋酶 （ helicase） ?Rep蛋白 ? 單鏈結(jié)合蛋白（ ssb） ?起穩(wěn)定單鏈 DNA的作用 ? 拓?fù)洚悩?gòu)酶 ?復(fù)制前拓?fù)洚悩?gòu)酶切斷 DNA雙鏈，松開正超螺旋，復(fù)制后重新使 DNA雙鏈連接，形成負(fù)超螺旋。 拓?fù)洚悩?gòu)酶 ? 拓?fù)洚悩?gòu)酶在 復(fù)制叉處消除解鏈過程中產(chǎn)生的超螺旋 。 ? 拓?fù)洚悩?gòu)酶 Ⅰ 切開一條鏈，釋放超螺旋后，再連接封閉。 ? 拓?fù)洚悩?gòu)酶 Ⅱ 同時(shí)切開兩條鏈，再連接封閉。 原核細(xì)胞中的 DNA聚合酶 ? polⅠ 主要在 DNA修復(fù)中起作用。 多功能酶，活性包括： ?5?→3?DNA 聚合酶活性； ?3?→5? 核酸外切酶活性；（校正作用） ?5?→3? 核酸外切酶活性；（缺口平移或切除岡崎片段 5?引物） ? Klenow片段：5?→3?DNA 聚合酶活性； 3?→5? 核酸外切酶活性； ? pol Ⅲ 又稱為 DNA聚合酶 Ⅲ 全酶 真正的 DNA復(fù)制酶。 活性 ?5?→3?DNA 聚合酶活性 ?3?→5? 核酸外切酶活性 ? polⅡ 具有 3?→5? 核酸外切酶活性，所以在 DNA修復(fù) 中有作用。 原核 DNA復(fù)制中的酶 拓?fù)洚悩?gòu)酶 解鏈酶 5/ 3/ 3/ 5/ 3/ 5/ DNA聚合酶 Ⅲ 單鏈結(jié)合蛋白 DNA聚合酶 Ⅰ 前導(dǎo)鏈