【文章內(nèi)容簡介】 沉淀的水溶性聚合物為親和配基的載體，從而利用目標分子與其親和配基的特異性結(jié)合作用及沉淀分離的原理進行目標大分子的分離純化，是蛋白質(zhì)等生物大分子的新型親和技術(shù)之一。由于生物親和相互作用的選擇性高，離心分離法操作簡便、易于放大，因此親和沉淀法不僅具有接近于親和層析法的純化效率，而且可彌補親和層析法放大困難的缺點。此外親和沉淀操作中目標分子與配基的親和相互作用在水溶狀態(tài)下，傳質(zhì)阻力小、吸附速率快、可處理高粘度甚至含微粒的粗原料[6]。親和膜色譜技術(shù)是兼具膜分離與親和分離的特點，與傳統(tǒng)的膜分離、親和色譜相比，不僅具有純化倍數(shù)高，壓降小，分離時間短，生物大分子在分離過程中變性幾率小，允許較快的加料速度等特點，而且比柱親和色譜更易實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。固體親和層析法是指蛋白質(zhì)分子能夠與金屬離子發(fā)生親和反應并與之結(jié)合，用于分離純化蛋白質(zhì)。用螯合劑將特定的金屬離子固定在固體表面會減少蛋白質(zhì)一金屬相互反應的自由度，蛋白質(zhì)因此不容易失活，可以保持較高的活性。它的優(yōu)點是可用不同的金屬離子固定到螯合載體上，用一種更強的螯合劑將所用的螯合劑洗脫下來從而實現(xiàn)再生。 反膠團萃取法當表面活性劑溶于大量與水不相溶的有機溶劑中，達到一定濃度時，會形成極性頭在內(nèi)，非極性頭在外的聚集體，這種聚集體為反膠團。當體系中含量一定量的水，則在反膠團中心有一個水池，可以包圍水溶性的蛋白質(zhì)分子。這種反膠團的有機溶劑與蛋白質(zhì)水溶液混合時，一定條件下，蛋白質(zhì)分子能夠從水相進入到反膠團的中心水池，經(jīng)過分相后，再將有機相與另一水相接觸，改變條件，即可打開膠團，釋放蛋白質(zhì)分子，從而達到萃取分離的目的。 雙水相萃取法當兩種高聚物的的水溶液相互混合時，若兩種被混合分子間存在空間排斥作用，使它們之間無法相互滲透，則在達到平衡時就有可能分成兩相，形成雙水相。兩相的組成和密度均不相同，通常密度較小的一相浮于上方，為上相；密度較大的一相沉于下方，為下相。一般認為，只要兩種聚合物水溶液的水溶性有所差異，混合時就可以發(fā)生相分離，并且差別越大，相分離傾向就越大。聚乙二醇／葡聚糖和聚乙二醇／無機鹽是常用的雙水相體系，由于葡聚糖價格昂貴，因此聚乙二醇／無機鹽體系應用更為廣泛。聚乙二醇／無機鹽中所用的無機鹽主要是磷酸鹽和硫酸鹽。 超濾法超濾法是一種新興的分離純化物質(zhì)的技術(shù)，它是利用濾膜的孔徑大小來篩分不同的物質(zhì)，達到過濾雜質(zhì)，使得水以及小分子物質(zhì)通過，從而獲得產(chǎn)物的效果，一般在反滲析和濃縮等方面應用得多，近來也在蛋白質(zhì)的分離純化中得到越來越多的應用。與傳統(tǒng)的分離技術(shù)相比，它的特點是產(chǎn)出量高，活性大，雜質(zhì)少，純度也較高。 課題研究目的和意義溶菌酶存在于自然界的動物植物微生物中，除了人體之外，蛋清中的含量最為豐富，蛋殼膜中也有存在。蛋殼重量占整個雞蛋的11%～13%，殼內(nèi)膜約占蛋殼重量的4%～5%。本實驗就是從廢棄的蛋殼中提取出溶菌酶。蛋類是全人類共同的優(yōu)質(zhì)動物性食品，隨著禽蛋生產(chǎn)與消費的日益增加，其不可食用部分——蛋殼就大量產(chǎn)生，在一個千萬人口的城市，如每人每日丟棄一個蛋殼，按通常蛋殼在全蛋重量中的比重計算，一年下來，其量之巨，需5700輛5t大貨車才能裝運。我國的廢棄蛋殼主要來源于大量消費雞蛋的食品廠、孵化場、酒家等單位，而成批拋棄的蛋殼很快就會腐敗變質(zhì)，造成環(huán)境污染，在不遺余力地尋求解決垃圾污染、破壞環(huán)境的措施時，垃圾的減量化、資源化則是最具積極意義的，最值得提倡的。在各類動物性食品的廢棄物中，其骨、皮、血的資源化程度較高，市場上有多種骨鈣補劑、氨基酸、膠原蛋白功能制劑等，但尚未見到蛋殼鈣劑、蛋殼蛋白、蛋殼膠原等商品，蛋殼的開發(fā)利用明顯滯后，這與長期以來蛋殼來源十分分散有直接關(guān)系。已有研究表明，蛋殼含有豐富的鈣、角蛋白、粘多糖、溶菌酶等成分，又基于蛋殼資源數(shù)量巨大，永不衰竭，綜合利用深度加工就顯得特別必要。現(xiàn)代蛋制品加工業(yè)的發(fā)展將在很大程度上改變蛋殼來源分散、不易收集、污染嚴重的現(xiàn)狀，因此，對蛋殼資源化研究與開發(fā)具有重要的理論與實踐意義[9]。目前雖然對溶菌酶的研究較多，但是缺乏適于工業(yè)化生產(chǎn)溶菌提取的可行性工藝及溶菌酶在食品中的研究，對溶菌酶的性質(zhì)等的報道也說法不一，為了更好的將溶菌酶應用于醫(yī)藥、食品等行業(yè)中，有必要對溶菌酶的提取、性質(zhì)及應用進行系統(tǒng)性的研究本試驗即以綜合利用蛋殼為目的，研究了適宜工業(yè)化生產(chǎn)的溶菌酶提取工藝，該工藝具有工藝過程簡單、提取效率髙、酶活力較高、成本低、生產(chǎn)周期短、可連續(xù)生產(chǎn)的特點，并對溶菌酶的穩(wěn)定性、抑菌能力等也進行了研究，為溶菌酶的應用提供可行性依據(jù)[10]。 本課題主要研究內(nèi)容 本課題以蛋殼綜合利用為目的，主要內(nèi)容包括蛋殼溶菌酶的分離純化、溶菌酶酶活性質(zhì)研究。但溶菌酶在雞蛋殼中含量很低，所以我將采用聚丙烯酸沉淀法從廢棄蛋殼中提取溶菌酶進行初步的研究，將經(jīng)過提、除雜蛋白、吸附、鹽析等一系列步驟成功地提取出蛋殼中的微量溶菌酶，討論不同的條件對抽提的影響；本試驗在參考相關(guān)文獻的基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化試驗條件，在溶菌酶酶活性質(zhì)研究過程中，以枯草芽孢桿菌作為研究對象，研究溶菌酶對枯草芽孢桿菌的抑制作用及在不同的抽提條件下提取的溶菌酶的酶活力。第2章 溶菌酶的提取、鑒定和酶活力的測定第2章 溶菌酶的提取、鑒定和酶活力的測定 實驗材料和藥品實驗材料：雞蛋殼（去校外超市購買）實驗藥品：表21 實驗所用藥品藥品名稱純度/濃度氯化鈉≥%（分析純）氫氧化鈉≥%無水氯化鈣≥%（分析純）碳酸鈉≥%（分析純）聚丙烯酸PAA冰醋酸99%（分析純）鹽酸36%38%（分析純）磷酸二氫鉀≥%（分析純）磷酸85%（分析純)無水乙醇99%（分析純）丙烯酰胺≥95%（分析純）亞甲基雙丙烯酰胺≥%Tris%（分析純）DSD10%過硫酸銨≥%TrisHCl甘油≥95%（分析純）β巰基乙醇≥95%（分析純）溴酚藍%考馬斯亮藍R250≥95%（分析純）甲醇50%附表21續(xù)表藥品名稱純度枯草芽孢桿菌實驗室提供磷酸二氫鉀≥%（分析純）磷酸85%（分析純) 試驗儀器表22 實驗所用儀器儀器名稱型號/規(guī)格數(shù)顯恒溫水浴鍋HH1高壓滅菌鍋YXQSG46280S低速離心機802B恒溫磁力攪拌器852燒杯1000ml，500ml，50ml電子天平FA1004N移液管1mlpH計PHS3C電泳槽DYY12電泳儀DYY12容量瓶25ml，100ml分光光度計722比色管50ml 工藝流程 濾渣(棄去)蛋殼 雜蛋白(棄去) 濾液 上層清液(棄去) 上層清液 吸附物 濾渣(棄去) 濾液(棄去) 上層清液 結(jié)晶物 鑒定 測定酶活力 實驗過程 溶菌酶的提取蛋殼的預處理：將新鮮蛋殼用自來水進行沖洗，洗去殘余的蛋清和蛋殼表面的污垢，然后再用蒸餾水漂洗一遍，漂洗后的蛋殼濾干水分后置于干燥處10h，使蛋殼中的水分蒸發(fā)。抽提：稱取750g清洗干凈的蛋殼用900ml的一定濃度的NaCl溶液泡后，用2molL1的HCl調(diào)pH值，然后每10分鐘測一次pH值并且調(diào)整，在水浴鍋中加熱4h，在這過程中不停的攪拌并且調(diào)整pH值，始終讓溶液中的pH值保持不變，然后用篩子將蛋殼過濾掉[11]。保持溫度為40℃，氯化鈉濃度為2%、進行抽提；，氯化鈉濃度為2%不變，分別保持溫度為25℃（室溫）、30℃、35℃、40℃和45℃條件進行抽提；，溫度40℃不變，%、1%、%和2%、%進行抽提。除雜蛋白：將水浴鍋的溫度調(diào)到80℃，將燒杯溶液的pH值用1:，迅速放入水浴鍋攪拌加熱，不停的攪拌，當溫度到達77℃時發(fā)現(xiàn)有白色沉淀析出，開始計時，10分鐘后取出燒杯靜置。3個小時以后，發(fā)