酶工程實驗生物工程(編輯修改稿)
2025-02-02 15:53 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 l容量瓶中，定容，搖勻（冰箱中 4℃ 保存期約一星期）。 醋酸 buffer()稱取 ，溶解于150ml蒸餾水，用冰乙酸調(diào)節(jié)其 ph至 ，然后定溶至200mL。 10%蔗糖溶液： 10g蔗糖溶解于 醋酸 buffer()中，定容至 100ml 1mol/L NaoH溶液： 4gNaoH溶解于 100ml蒸餾水中 四、結(jié)果分析 以梯度洗脫出的管數(shù)為橫坐標(biāo)，以吸光度 A280、酶活、 NaCl濃度為縱坐標(biāo)，繪出層析曲線和酶活曲線圖。 五 思考題： ① 離子交換纖維素層析的優(yōu)點有哪些？ ② 有機(jī)溶劑抽提蛋白質(zhì)的原理是什么？ 數(shù)據(jù)處理 Review ?Total activity ?Specific activity— how to calculate it, what it means, how it changes during a purification ?Fold purification— what it is, how to calculate it ?Yield— what it is, how to calculate it, how it changes during a purification 兩重要概念 1：回收率是純化后的總活力除以純化前的總活力 2： 純化倍數(shù)是純化后的比活力除以純化前的比活力（第一次的比活力） 注：比活力：比活力＝活力單位數(shù)／ mg蛋白 實驗二 SDSPAGE電泳 一、實驗步驟 1. 試劑配制 （ 1）丙烯酰胺和 N, N’亞甲雙丙烯酰胺。以溫?zé)幔ɡ谌芙怆p丙烯酰胺）的去離子水配制含有 29%（ w/v）丙烯酰胺和 1%（ w/v） N, N’亞甲雙丙烯酰胺的貯存液 。 （ 2） Tris， （分離膠緩沖液）： TrisHCl， % SDS （ 3） Tris， （濃縮膠緩沖液）： TrisHCl， % SDS （ 4） 10%過硫酸銨 以上先配！ 等待凝膠聚合時再配！ （ 8） Tris甘氨酸電泳緩沖液 (pH )： Tris， 甘氨酸， % SDS （ 9）樣品處理液： 50mM TrisHCl(pH )，100mM DTT(or 5% 巰基乙醇 )， 2% SDS， % 溴酚藍(lán)， 10%甘油 （ 10）染色液： % 考馬斯亮藍(lán) R250， 40% 甲醇， 10% 冰醋酸 （ 11）脫色液： 10% 甲醇， 10% 冰醋酸 2. SDS聚丙烯酰胺凝膠的灌制 （ 1）根據(jù)廠家說明書安裝玻璃板 （ 2）確定所需凝膠溶液體積，按下表給出的數(shù)值在一小燒杯中按所需丙烯酰胺濃度配制一定體積的分離膠溶液。一旦加入 TEMED，馬上開始聚合，故應(yīng)立即快速旋動混合物并進(jìn)入下步操作。 （ 3）迅速在兩玻璃板的間隙中灌注丙烯酰胺溶液 ,留出灌注濃縮膠所需空間 (梳子的齒長再加 )。再在膠液面上小心注入一層水（約 2~3mm高），以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液。 （ 4）分離膠聚合完全后（約 30分鐘），傾出覆蓋水層，再用濾紙吸凈殘留水。 （ 5）制備濃縮膠：按下表給出的數(shù)據(jù)，在另一小燒杯中制備一定體積及一定濃度的丙烯酰胺溶液，一旦加入 TEMED，馬上開始聚合，故應(yīng)立即快速旋動混合物并進(jìn)入下步操作。 （ 6）聚合的分離膠上直接灌注濃縮膠 ,立即在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子。小心避免混入氣泡，再加入濃縮膠溶液以充滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下。 （ 7）在等待濃縮膠聚合時，可對樣品進(jìn)行處理，在樣品中按 1:1體積比加入樣品處理液，在 100℃ 加熱 3分鐘以使蛋白質(zhì)變性。 （ 8）濃縮膠聚合完全后（ 30分鐘），小心移出梳子。把凝膠固定于電泳裝置上，上下槽各加入 Tris甘氨酸電極緩沖液。必須設(shè)法排出凝膠底部兩玻璃板之間的氣泡。 3. 樣品的處理 將 100ul蛋白樣品與 100ul樣品處理液混合均勻，然后將此混合液在 100攝氏度中水浴10min，冷卻至室溫后， 12022rpm離心 10分鐘，即做成電泳樣品。 （ 1）按予定順序加樣，加樣量通常為 10～ 25μl （ ）。 （ 2）將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為 8V/cm。當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后，把電壓提高到 15V/cm，繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部上方約 1cm，然后關(guān)閉電源。 （ 3）從電泳裝置上卸下玻璃板，用刮勺撬開玻璃板。緊靠最左邊一孔（第一槽）凝膠下部切去一角以標(biāo)注凝膠的方位。 經(jīng) SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)樣品可用考馬斯亮藍(lán) R250染色。染色 1～ 2小時或過夜。 需 3～ 10小時，其間更換多次脫色液至背景清楚 脫色后，可將凝膠浸于水中，長期封裝在塑料袋內(nèi)而不降低染色強(qiáng)度。為永久性記錄，可對凝膠進(jìn)行拍照，或?qū)⒛z干燥成膠片。此方法檢測靈敏度為 ～ 。 二 .結(jié)果分析 觀察并記錄實驗結(jié)果，判斷酶的純度，拍出電泳酶純度的檢驗結(jié)果。 實驗三 酵母蔗糖酶的結(jié)晶 （蒸發(fā)和沉淀法相結(jié)合的懸滴蒸汽擴(kuò)散結(jié)晶法） 一、原理
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