生物化學(xué)第10章酶的作用機(jī)制和酶的調(diào)節(jié)(編輯修改稿)
2025-02-12 13:26 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 (水 蛭 蛋 白酶抑制劑 ) 藍(lán)色 His57 紅色 Asp102 黃色 Ser195 人工底物 對(duì)一些底物是大分子聚合物的酶 ， 在研究其動(dòng)力學(xué)時(shí) ， 一般使用小分子的人工底物 。 乙酸 p硝基苯酯是一種特別有用的模式底物 ， 因?yàn)槠渌猱a(chǎn)物對(duì)硝基苯酚在 400nm有強(qiáng)的光吸收 ， 便于監(jiān)測(cè)其變化 。 研究胰凝乳蛋白酶的人工底物 乙酰苯丙氨酸甲酯 苯甲酰丙氨酸甲酯 甲酰苯丙氨酸甲酯 乙酸 p硝基苯酯 胰凝乳蛋白酶催化機(jī)制的動(dòng)力學(xué)研究 當(dāng)大量胰凝乳蛋白酶用乙酸 p硝基苯酯為底物進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究時(shí) ， 反應(yīng)分兩個(gè)不同的階段 ， 反應(yīng)開始時(shí)以突發(fā)的速率 生成 p硝基苯酚 ， 隨后出現(xiàn)一個(gè)較慢的穩(wěn)態(tài)速率 。 這是因?yàn)榉磻?yīng)的第一步是底物與酶結(jié)合后 ， 反應(yīng)釋放出 p硝基苯酚 ， 另一個(gè)產(chǎn)物乙酸以乙酰基的形式結(jié)合在酶活性部位的 Ser195上 。 第二步是水分子攻擊乙酰 －酶復(fù)合物 ， 釋放出乙酸根離子 。 第二步較緩慢 ， 是限速步驟 。 胰凝乳蛋白酶同底物反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線 ?；钢虚g物的迅速形成后緩慢釋放產(chǎn)物 胰凝乳蛋白酶的催化三聯(lián)體 胰凝乳蛋白酶中催化三聯(lián)體的作用 在沒有底 物時(shí) ， His57是未質(zhì)子化的 ， 當(dāng) Ser195羥基氧原子對(duì)底物進(jìn)行親核攻擊時(shí) ， His57從 Ser195接受一個(gè)質(zhì)子 。 Asp102的 COO－ 的作用是穩(wěn)定過(guò)渡態(tài)中 His57的正電荷形式 。 此外 ， Asp定向 His57， 保證從 Ser195接受一個(gè)質(zhì)子后的 His57處于適當(dāng)?shù)幕プ儺悩?gòu)形式 。 His57的互變異構(gòu) 胰凝乳蛋白酶的催化機(jī)制 Ⅰ 胰凝乳蛋白酶的催化機(jī)制 Ⅱ 五、酶活性的調(diào)節(jié)控制 別構(gòu)調(diào)控 （ allosteric regulation） 酶分子的非催化部位與某些化合物可逆地非共價(jià)結(jié)合后 ,酶發(fā)生構(gòu)象改變 ， 進(jìn)而改變酶活性狀態(tài) ，稱為酶的別構(gòu)調(diào)節(jié) 。 具有這種調(diào)節(jié)作用的酶稱為別構(gòu)酶 （ allosteric enzyme） 。 凡能使酶分子發(fā)生別構(gòu)作用的物質(zhì)稱為效應(yīng)劑或別構(gòu)劑 ， 能增加酶活性的別構(gòu)劑為別構(gòu)激活劑 ， 能抑制酶活性的別構(gòu)劑為別構(gòu)抑制劑 。 天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶 （ aspartate transcarbamylase， ATCase） ATCase是嘧啶生物合成途徑的第一個(gè)酶 ， 底物對(duì)酶的結(jié)合有正協(xié)同性 。 該反應(yīng)途徑的終 產(chǎn)物CTP是 ATCase的反饋抑制劑 ， 抑制程度可達(dá) 90%，這種抑制是降低酶對(duì)底物的親和力 ， 但不影響最大反應(yīng)速度 。 而 ATP是 ATCase的激活劑 ， 可增加酶對(duì)底物的親和力 ， 也不影響最大反應(yīng)速度 。 ATCase催化的反應(yīng)式 ATP和 CTP對(duì) ATCase活性的影響曲線 ATP 可阻遏 CTP 的抑制作用 ，它們 競(jìng)爭(zhēng)同一結(jié)合位點(diǎn) 。 脫敏反應(yīng) ATCase由催化亞 基 （ catalytic subunit） 和調(diào)節(jié)亞基 （ regulatory subunit） 組成 。 當(dāng)用汞化物處理該酶時(shí) ， 則 ATCase失去調(diào)節(jié)活性 。 用汞化物處理過(guò)的 ATCase， ATP和 CTP不再影響其催化活性 ， 而且底物結(jié)合 變?yōu)闊o(wú)協(xié)同性 。 但并不影響酶的最大反應(yīng)速率 。 p羥汞苯甲酸對(duì)巰基的修飾 ATCase的亞基分離 當(dāng)用汞化物 p羥汞苯甲酸處理 ATCase時(shí) ， p羥汞苯甲酸與巰基反應(yīng) ， 使酶失去了受 ATP或CTP調(diào)節(jié)的能力 。 利用超離心分析 ， 天然酶的沉降系數(shù)為 ， 分子量為 310 103， 而受 p羥汞苯甲酸處理后的酶出現(xiàn)兩條帶 ， 一個(gè)是 ， 分子量 34 103， 另一個(gè)是 ， 分子量 100 103。這是兩種不同的亞基 ， 這兩種亞基也可以利用離子交換層析或蔗糖密度梯度離心分開 。 ATCase的沉降速率模式 天然 ATCase 通過(guò)汞化物解離成調(diào)節(jié)亞基和催化亞基的酶 ATCase的亞基組成 大的亞基叫催化亞基 ， 單獨(dú)的大亞基有催化反應(yīng)的能力 ， 但不與 ATP或 CTP結(jié)合 。 小亞基叫調(diào)節(jié)亞基 ， 單獨(dú)的小亞基可以與 ATP或 CTP結(jié)合 ，但無(wú)催化能力 。 催化亞基 （ c3） 含 3條 c鏈 ， 每條鏈的分子量為 34 103， 所以催化亞基的分子量是102 103；調(diào)節(jié)亞基 （ r2） 含 2條 r鏈 ， 每條鏈的分子量為 17 103， 所以調(diào)節(jié)亞基的分子量是34 103。 全酶含有 2個(gè)催化亞基和 3個(gè)調(diào)節(jié)亞基 ，記為 c6r6， 即 2c3＋ 3 r2 → c6 r6。 ATCase是別構(gòu)酶的模式對(duì)象 用過(guò)量的巰基乙醇可除去汞苯甲酸基 。 將除去汞苯甲酸基的催化亞基和調(diào)節(jié)亞基混合 ， 可重組得到天然酶 。 因 ATCase的催化亞基和調(diào)節(jié)亞基容易分開 ， 又容易重組 ， 所以它成為研究別構(gòu)酶的模式對(duì)象 。 ATCase的三維結(jié)構(gòu) 利用 X光衍射 ， 得出了 ATCase的三維結(jié)構(gòu) 。 通過(guò)使酶與競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑 N（ 膦乙?；?） L天冬氨酸 （ PALA） 結(jié)合 ， 找到了底物的結(jié)合位點(diǎn) ， 它位于兩條催化鏈的界面處 ， 由兩條 c鏈的殘基共同組成 。 每條 r鏈分兩個(gè)結(jié)構(gòu)域 ， 外側(cè)的結(jié)構(gòu)域是 CTP的結(jié)合位點(diǎn) ， 里側(cè)的結(jié)構(gòu)域與催化亞基相互作用 。每條 c鏈也分為兩個(gè)結(jié)構(gòu)域 ， N端為氨甲酰磷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域 ， C端為天冬氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域 。 ATCase的亞基結(jié)合方式 r r c c ATCase的亞基結(jié)合方式 ATCase半分子的三維結(jié)構(gòu) ATCase的過(guò)渡態(tài)底物及競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑 PALA結(jié)合在 ATCase催化部位上的方式 由鄰近 C鏈提供 酶與底物結(jié)合后的構(gòu)象變化 底物與酶結(jié)合后 ， 導(dǎo)致酶的沉降系數(shù)降低3%， 說(shuō)明酶與底物結(jié)合后膨脹了 。 伴隨著酶與PALA的結(jié)合 ， 酶的四級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了大的變化 ，兩個(gè)催化三聚體分開了 ， 并轉(zhuǎn)
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