【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 olume20逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42176。C40分鐘5. 管家基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)驗(yàn)證逆轉(zhuǎn)錄是否成功① 采用2Taq PCR Mastermix試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，總反應(yīng)體積25ml。具體如下：試劑每一反應(yīng)體系中的加樣量 (ml)2Taq PCR Mastermix上游引物(10Mm)1下游引物(10Mm)1cDNA模板XddH2o總反應(yīng)體積25首先進(jìn)行管家基因的PCR反應(yīng)，如出現(xiàn)預(yù)期的清晰單一PCR擴(kuò)增條帶，表明逆轉(zhuǎn)錄成功，制備的cDNA可用于IKZF1目標(biāo)基因的巢式PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為：95176。C預(yù)變性3分鐘，然后95176。C 30秒，58176。C30秒，72℃ 30秒，共30個(gè)循環(huán)，最后72176。C 5分鐘。② PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5ml加樣于2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳(電壓120V)后，然后采用凝膠圖像分析儀進(jìn)行電泳圖像采集和分析。6. 巢式PCR檢測(cè)IZKF1基因表達(dá)情況為了提高IZKF1基因的擴(kuò)增特異性，采用對(duì)應(yīng)于IZKF1基因的第1號(hào)外顯子和第8號(hào)外顯子的兩對(duì)引物進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)，保證能擴(kuò)增出全長(zhǎng)IZKF1轉(zhuǎn)錄本和可能出現(xiàn)的所有可變剪接轉(zhuǎn)變本。第一輪PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件 cDNA模板進(jìn)行巢樣式PCR第一輪反應(yīng)，具體反應(yīng)體系如下：反應(yīng)體系μl/管cDNA模板2上游引物 F1(10pmol/L)1下游引物 R1 (10pmol/L)12*Taq Master MixddH20總反應(yīng)體積25第一輪巢式PCR的反應(yīng)條件為：首先于95176。C變性5分鐘， 95176。C30秒；60176。C45秒；72176。C30秒；然后進(jìn)行35個(gè)PCR循環(huán)，最后72176。C終延伸5分鐘。第二輪PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件 ddH20混合（稀釋20倍），然后從中吸取1μl作為第二輪PCR反應(yīng)的模板，具體反應(yīng)體系如下：反應(yīng)體系μl/管cDNA模板1上游引物 F1(10pmol/L)1下游引物 R1 (10pmol/L)12*Taq Master MixddH20總反應(yīng)體積25第二輪巢式PCR的反應(yīng)條件為：首先于95176。C變性5分鐘，然后進(jìn)行35個(gè)PCR循環(huán)，95176。C30秒；62176。C45秒；72176。C30秒；最后72176。C終延伸5分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同樣于2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳(電壓120V)和凝膠圖像分析。7. DNA測(cè)序?yàn)榱蓑?yàn)證是否真正擴(kuò)增出了全長(zhǎng)IKZF1轉(zhuǎn)錄本及其多種可變剪接轉(zhuǎn)錄本，從瓊脂糖凝膠上剪切下與對(duì)應(yīng)于IKZF1各種轉(zhuǎn)錄本大小的清晰電泳條帶，分別純化后送天根生化科技(北京)有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序，并要求對(duì)大片段擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序。DNA測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI BLASTN在線軟件進(jìn)行比對(duì)和驗(yàn)證。四，統(tǒng)計(jì)分析采用卡方檢驗(yàn)比較組間或多組間IK陽(yáng)性表達(dá)率，以P。結(jié) 果一、 RNA純度和完整性的檢測(cè)采用分光光度計(jì)檢測(cè)提取制備的RNA樣品OD值。如OD260/~，表明提取制備的RNA純度較好。將RNA樣品于1%瓊脂糖凝膠電泳(電壓130V) 20分鐘，可見(jiàn)28S、18S和5S三條清晰明亮的條帶(圖1)，表明提取制備的RNA無(wú)明顯降解及污染，純度較高。二、 普通PCR驗(yàn)證逆轉(zhuǎn)錄是否成功采用GAPDH管家基因特異性引物和上述方法部分所述反應(yīng)體系和條件，進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增反應(yīng)，驗(yàn)證逆轉(zhuǎn)錄是否成功。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳后，結(jié)果檢測(cè)出對(duì)應(yīng)于預(yù)期大小的單一清晰條帶，證實(shí)逆轉(zhuǎn)錄成功，制備的cDNA可用于目標(biāo)基因IKZF1的巢式PCR反應(yīng)。圖2. 部分標(biāo)本GAPDH管家基因普通PCR擴(kuò)增結(jié)果三、 IKZF1基因巢式RTPCR擴(kuò)增結(jié)果按方法部分所述反應(yīng)體系和條件，分別以兩對(duì)IKZF1基因特異性引物進(jìn)行兩輪PCR反應(yīng)，檢測(cè)IKZF1基因表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：⑴ 健康對(duì)照兒童外周血單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)各種IKZF1可變剪轉(zhuǎn)錄本，包括顯性負(fù)轉(zhuǎn)錄本。從圖3可以比較直觀地發(fā)現(xiàn)，健康對(duì)照兒童外周血單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)的IKZF1轉(zhuǎn)錄本中，IK2表達(dá)水平最高并表達(dá)于所有20例對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞(除對(duì)照8)，提示IKZF1基因編碼的野生型Ikaros蛋白（如IK2）在正常造血方面具有重要調(diào)節(jié)作用，而顯性負(fù)異構(gòu)體的表達(dá)可能也發(fā)揮著重要的平衡制約調(diào)節(jié)作用。⑵ 43例ALL患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞也表達(dá)IKZF1各種可變剪接轉(zhuǎn)錄本，但不同ALL患兒IKZF1可變剪接轉(zhuǎn)錄本表達(dá)情況差異很大，部分患兒以IK6和IK8等顯性負(fù)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)為主(圖4)。ALL患兒IKZF1基因表達(dá)情況或可變剪接本的表達(dá)譜(expression pattern)與健康對(duì)照兒童具有很大的差異，進(jìn)一步印證了國(guó)外學(xué)者的研究報(bào)道，高度提示IKZF1基因的異常表達(dá)(顯性負(fù)轉(zhuǎn)錄本編碼的Ikraos異構(gòu)體蛋白)與白血病發(fā)病可能具有極為密切的關(guān)系。圖4. 部分ALL患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞IKZF1表達(dá)情況四、 DNA測(cè)序結(jié)果為了驗(yàn)證是否真正擴(kuò)增出了各種IKZF1可變剪接轉(zhuǎn)錄本，我們選擇了與各種可變剪接轉(zhuǎn)錄本預(yù)期大小對(duì)應(yīng)的6種第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)NCBI BLASTN在線軟件進(jìn)行了比對(duì)和驗(yàn)證，并根據(jù)IKZF1 mRNA (NM_006060)全長(zhǎng)序列和外顯子位置進(jìn)行分析判斷。測(cè)序結(jié)果證實(shí)，我們送檢的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之一包含IKZF1基因第2號(hào)外顯子的部分序列、外顯子3~7的所有序列，以及對(duì)應(yīng)于第8號(hào)外顯子5’端的部分序列(設(shè)計(jì)的IKZF1基因特異性下游引物序列正好對(duì)應(yīng)于這段序列)，相似性達(dá)99%，從而證實(shí)為IK1 (圖5，圖6)。同樣方法證實(shí)，其他第二輪PCR產(chǎn)物分別為IKIKIK6和IK8。圖5：第二輪PCR產(chǎn)物之一測(cè)序結(jié)果圖6：第二輪PCR產(chǎn)物測(cè)序后Blast Search結(jié)果表明與IZKF1 mRNA序列同源性高達(dá)99%五、 研究對(duì)象單個(gè)核細(xì)胞IKZF1基因表達(dá)情況根據(jù)正常對(duì)照兒童外周血單個(gè)核細(xì)胞和ALL患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞IKZF1各種可變剪接表達(dá)本的電泳條帶位置，結(jié)合測(cè)序結(jié)果，確定IKZF1基因各種可變剪接本的表達(dá)情況。標(biāo)本陽(yáng)性表達(dá)IK剪接本標(biāo)本陽(yáng)性表達(dá)IK剪接本4ik1+ik212ik2+ik4+ik65ik1+ik2+ik413ik2+ik4+ik66ik1+ik2+ik49ik2+ik4+ik67ik1+ik2+ik417ik2+ik4+ik61ik1+ik2+ik4+ik82ik2+ik4+ik83ik1+ik2+ik4+ik810ik2+ik4+ik811ik2+ik418ik2+ik4+ik815ik2+ik419ik2+ik4+ik816ik2+ik420ik2+ik4+ik8+ik614ik2+ik68ik8+ik4表1. 20名健康對(duì)照兒童外周血單個(gè)核細(xì)胞IKZF1基因表達(dá)情況 從上表也可看出，除第8例對(duì)照兒童外，所有對(duì)照兒童外周血單個(gè)核細(xì)胞均表達(dá)IK1和或IK2；除第4例對(duì)照兒童外，所有對(duì)照兒童也均表達(dá)顯性負(fù)可變轉(zhuǎn)錄本IK4和或IK6和或IK8。病例編號(hào)陽(yáng)性表達(dá)IK轉(zhuǎn)錄本病例編號(hào)陽(yáng)性表達(dá)IK轉(zhuǎn)錄本病例編號(hào)陽(yáng)性表達(dá)IK轉(zhuǎn)錄本72IK199IK2+IK4+IK82IK4A10IK1107IK2+IK4+IK896IK4A+IK636IK180IK2+IK4+IK897IK4+IK678IK2100IK2+IK4+IK8+IK686IK4+IK61IK261IK2+IK4+IK8+IK694IK4+IK889IK1+ik276IK2+IK4+IK8+IK648IK695IK1+ik679IK2+IK4+IK8+iIK664IK693IK1+IK2+IK463IK2+IK4+IK8+IK669IK6101IK2+ik4104IK2+IK4+IK8+IK692IK6105IK2+ik460IK2+IK4+IK8+IK659IK6103IK2+IK415IK4A90IK691IK2+ik465IK450IK6+IK868IK2+ik6106IK4A70IK871IK2+IK4+IK881IK882IK8102IK2+IK4+IK8表2 43名兒童ALL患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞IKZF1基因表達(dá)情況結(jié)合圖4和表2，可以比較直觀地發(fā)現(xiàn)，多數(shù)ALL患兒表達(dá)各種“顯性負(fù)”IK轉(zhuǎn)錄本，部分患兒甚至僅表達(dá)一種或多種“顯性負(fù)”IK轉(zhuǎn)錄本，這與健康對(duì)照兒童IK表達(dá)譜存在顯著差異。六、 不同預(yù)后因素ALL患兒IK轉(zhuǎn)錄本陽(yáng)性表達(dá)率分析為了了解IK可變剪接轉(zhuǎn)錄本(尤其是顯性負(fù)轉(zhuǎn)錄本)與ALL各種臨床危險(xiǎn)因素間的關(guān)系，進(jìn)行了如下統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。(一)、ALL與對(duì)照組功能性IK和顯性負(fù)IK轉(zhuǎn)錄本表達(dá)率比較ALL患兒與健康對(duì)照兒童IK1陽(yáng)性表達(dá)率的比較：分別統(tǒng)計(jì)ALL組和對(duì)照組IK1陽(yáng)性表達(dá)的例數(shù)，而無(wú)論其他IK可變轉(zhuǎn)錄本是否表達(dá)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明兩組間IK1陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(χ2=；P)。分組IK1陽(yáng)性表達(dá)(例)IK1陰性表達(dá)(例)合計(jì)(例)正常對(duì)照61420ALL患兒73643合計(jì)135063ALL患兒與健康對(duì)照兒童IK2陽(yáng)性表達(dá)率的比較：分別統(tǒng)計(jì)ALL組和對(duì)照組IK2陽(yáng)性表達(dá)的例數(shù)，而無(wú)論其他IK可變轉(zhuǎn)錄本是否表達(dá)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明兩組間IK2陽(yáng)性表達(dá)率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(χ2=；P)。分組IK2陽(yáng)性表達(dá)(例)IK2陰性表達(dá)(例)合計(jì)(例)正常對(duì)照19120ALL患兒222143合計(jì)412263ALL患兒與健康對(duì)照兒童功能性IK (IK1+IK2)陽(yáng)性表達(dá)率的比較：根據(jù)前言部分可知，IK1和IK2均為功能性或活性IK可變轉(zhuǎn)錄本，因此我們將兩者合并統(tǒng)計(jì)，比較ALL和對(duì)照組(IK1+IK2)陽(yáng)性表達(dá)率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=；P)。分組(IK1+IK2)陽(yáng)性(例)(IK1+IK2)陰性(例)合計(jì)(例)正常對(duì)照19120ALL患兒251843合計(jì)441963ALL患兒與健康對(duì)照兒童IK4陽(yáng)性表達(dá)率的比較：同樣方法統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明兩組間IK4陽(yáng)性表達(dá)率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(χ2=；P)。分組IK4陽(yáng)性表達(dá)(例)IK4陰性表達(dá)(例)合計(jì)(例)正常對(duì)照18220ALL患兒212243合計(jì)402463ALL患兒與健康對(duì)照兒童IK6陽(yáng)性表達(dá)率的比較：同樣方法統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明兩組間IK6陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(χ2=；P)。分組IK6陽(yáng)性表達(dá)(例)IK6陰性表達(dá)（例）合計(jì)（例）正常對(duì)照51520ALL患兒182543合計(jì)234063ALL患兒與健康對(duì)照兒童IK8陽(yáng)性表達(dá)率的比較：同樣方法統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明兩組間IK8陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(χ2=0；P)。分組IK8陽(yáng)性表達(dá)(例)IK8陰性表達(dá)(例)合計(jì)(例)正常對(duì)照81220ALL患兒172643合計(jì)253863ALL患兒與健康對(duì)照兒童顯性負(fù)IK陽(yáng)性表達(dá)率的比較：我們首先匯總具有一種或一種以上顯性負(fù)IK表達(dá)的研究對(duì)象，然后比較ALL患兒組與健康對(duì)照兒童組是否存在差異。同樣方法統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明兩組間所有顯性負(fù)IK陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(χ2=；P)。分組顯性負(fù)IK陽(yáng)性表達(dá)(例)顯性負(fù)IK陰性表達(dá)(例)合計(jì)(例)正常對(duì)照19120ALL患兒37643合計(jì)56763(二)、不同臨床危險(xiǎn)度ALL患兒IK轉(zhuǎn)錄本表達(dá)情況分析 為了進(jìn)一步探討功能性IK轉(zhuǎn)錄本和顯性負(fù)IK轉(zhuǎn)錄本與ALL各種臨床危險(xiǎn)因素的關(guān)系，我們分別比較了不同預(yù)后因素ALL組間功能性IK轉(zhuǎn)錄本和顯性負(fù)IK轉(zhuǎn)錄本陽(yáng)性表達(dá)率，結(jié)果如下： 不同臨床危險(xiǎn)度ALL組間IK1陽(yáng)性表達(dá)率的比較：結(jié)果表明組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異（χ2=；P）。臨床危險(xiǎn)度IK1陽(yáng)性表達(dá)(例)IK1陰性表達(dá)（例）合計(jì)（例）標(biāo)危ALL31215中危ALL3912高危ALL11516合計(jì)73643不同臨床危險(xiǎn)度ALL組間IK2陽(yáng)性表達(dá)率的比較：結(jié)果表明組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異（χ2=；P）。臨床危險(xiǎn)度IK2陽(yáng)性表達(dá)(例)IK2陰性表達(dá)（例）合計(jì)（例）標(biāo)危ALL10515中危ALL7512高危ALL51116合計(jì)222143不同臨床危險(xiǎn)度ALL組間（IK1+IK2）陽(yáng)性表達(dá)率的比較：結(jié)果表明組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異（χ2=；P）。由于各組（尤其是高危組）（IK1+IK2）陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)僅5例，從統(tǒng)計(jì)分析要求而言，不能進(jìn)一步分析各組間是否也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但可以直觀地看到，高危ALL組(IK1+IK2)%（6/16），而標(biāo)危組和中危組分別為80%（12/15）和67%（8/12）。臨床危險(xiǎn)度(IK1+IK2)陽(yáng)性(例)(IK1+IK2)陰性（例）合計(jì)（例）標(biāo)危ALL12315