【文章內(nèi)容簡介】 影響； C）對于重要功能因子制備特異性抗體，并運用酵母雙雜交、免疫共沉淀、染色質(zhì)免疫共沉淀（對轉(zhuǎn)錄因子或結(jié)合在染色質(zhì)上的蛋白復(fù)合物成員）篩選其相互作用因子或染色質(zhì)附著位點，從轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳調(diào)控、蛋白相互作用調(diào)控三個方面研究這些因子調(diào)控胰腺早期發(fā)育的分子機理。 2. 非洲爪蟾 預(yù)定的胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞 特異性調(diào)控因子的篩選和功能 機制 研究。 1） 非洲爪蟾囊胚晚期 /原腸早期預(yù)定 的 胰腺 和肝臟 內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞譜系分析定位 。利用 DMNBcaged fluorescein dextran 的單細(xì)胞激光定點 激發(fā) 進(jìn)行 內(nèi)胚層 細(xì)胞 的 譜系定位 。 2） 基因芯片比較正常的預(yù)定胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞與 BMS453 處理過的內(nèi)胚層細(xì)胞、高表達(dá)了 Hex 的內(nèi)胚層細(xì)胞 、 高表達(dá)了 VegT 和 βcatenin 的爪蟾胚胎多能性前體細(xì)胞的基因表達(dá)圖譜 以篩選出決定預(yù)定胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞的特異性內(nèi)在 調(diào)控因子 。 A）在上述細(xì)胞譜系定位的基礎(chǔ)上，進(jìn)行基因芯片差異表達(dá)篩 15 選； B）對于篩選得到的差異表達(dá)基因，研究其表達(dá)模式、過表達(dá)或敲降后所 導(dǎo)致的胰腺發(fā)育表現(xiàn)型以確定其對胰腺發(fā)育的重要性。 3） 篩選所得重要調(diào)控因子發(fā)揮功能的分子機理研究 。 A）對于篩選重要調(diào)控基因，研究其敲降或過表達(dá)對早期內(nèi)胚層或胰腺發(fā)育不同時期分子標(biāo)記表達(dá)的影響； B）對于重要的調(diào)控因子制備其抗體，并進(jìn)一步采用酵母雙雜交、免疫共沉淀、對于 DNA 結(jié)合因子采用 ChIPCloning，研究其相互作用因子、在染色質(zhì)上的結(jié)合位點、下游基因等，深入研究其調(diào)控胰腺發(fā)育的分子機理。 3. 非洲爪蟾 胰腺特異性表達(dá)的新基因的 篩選及 功能機制研究。 1） 利用大規(guī)模整體原位雜交從非洲爪蟾胚胎及成體的胰腺 cDNA 文庫 中篩選胰腺特異性表達(dá)的新基因。我們計劃從非洲爪蟾 34 期胚胎腹側(cè)胰腺原基特異的 cDNA 文庫及成體胰腺特異的 cDNA 文庫中，運用大規(guī)模整體原位雜交的方法分析 4000 個以上隨機挑選的克隆在不同時期胚胎中的表達(dá)，對胰腺特異性表達(dá)的克隆測序后選取其中的新基因進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。 2） 新基因調(diào)控胰腺發(fā)育的功能及分子機理研究。 A） 我們首先檢測早期內(nèi)胚層或胰腺發(fā)育不同時期的分子標(biāo)記，研究基因過表達(dá)或敲降導(dǎo)致胰腺發(fā)育缺陷表現(xiàn)型和具體發(fā)育時期； B）對于產(chǎn)生胰腺發(fā)育缺陷的重要調(diào)控因子，制備其抗體并進(jìn)一步采用酵母雙雜交、免疫共沉淀、對 于 DNA 結(jié)合因子采用ChIPCloning，研究其相互作用因子、在染色質(zhì)上的結(jié)合位點、下游基因等，深入研究其調(diào)控胰腺發(fā)育的分子機理。 4. Hex 特異性地誘導(dǎo)腹 側(cè) 胰腺前體細(xì)胞增多的分子機 理 研究 。 1） Hex 在原腸胚期過量表達(dá)誘導(dǎo)巨大腹側(cè)胰腺的細(xì)胞機制研究。 A）檢測 Hex過表達(dá)或敲降后胰腺的早期發(fā)育分子標(biāo)記 pdx p48/ptf1a、肝臟分子標(biāo)記prox1 表達(dá)； B）利用 BrdU 和 H3P（磷酸化組蛋白 H3）抗體染色，檢測Hex 的過表達(dá)對細(xì)胞增殖的影響，如果 Hex 過表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)胞增殖加快，我們將在使用細(xì)胞增殖抑制劑 的情況下檢測 Hex 的過表達(dá)對巨大腹側(cè)胰腺的 16 誘導(dǎo)能力； C）在斑馬魚中過表達(dá) Hex 以重復(fù)非洲爪蟾中的誘導(dǎo)巨大腹側(cè)胰腺的結(jié)果，如果得到類似結(jié)果，我們將利用細(xì)胞共移植技術(shù)研究 Hex 過表達(dá)對原腸胚期細(xì)胞遷移的影響，如果 Hex 過表達(dá)會影響細(xì)胞遷移，我們將在抑制原腸胚期細(xì)胞遷移的情況下檢測 Hex 的過表達(dá)對巨大腹側(cè)胰腺的誘導(dǎo)能力。由此，我們可以闡明 Hex 過表達(dá)是通過調(diào)控細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、還是細(xì)胞遷移來誘導(dǎo)巨大腹側(cè)胰腺的。 2） Hex 的相互作用因子、在染色質(zhì)上附著位點、下游調(diào)控基因的篩選及其調(diào)控胰腺發(fā)育的分子機理研究。 A） 利用 biotinylation/proteomics 篩選與 Hex 相結(jié)合的蛋白因子，確證它們的直接相互作用； B）通過多肽芯片及構(gòu)建系列突變體確證 Hex 與相互作用因子的結(jié)合區(qū)域，研究突變蛋白與完整蛋白的功能差異； C）制備 Hex 抗體，在原腸胚期爪蟾胚胎中進(jìn)行 ChIPCloning，篩選 Hex 在染色質(zhì) DNA 上的附著位點并確證； D） 檢測 Hex 功能異常是否導(dǎo)致了染色質(zhì)局部轉(zhuǎn)錄活性的變化； E）研究 Hex 過表達(dá)或敲降對其染色質(zhì)DNA 附著位點附近基因的轉(zhuǎn)錄水平的影響，研究相應(yīng)基因介導(dǎo) Hex 對胰腺發(fā)育調(diào)控作用的分子機理； F）通過 基因芯片篩選受 Hex 過表達(dá)影響的下游基因，研究這些下游基因介導(dǎo) Hex 對胰腺發(fā)育調(diào)控作用的分子機理。 5. 非洲 爪蟾胚胎胰腺 和肝臟 的 體外 重建。 1） 在經(jīng)過早期紫外線照射形成的爪蟾 belly piece中選擇性地恢復(fù)胰腺 和肝臟 形成 的研究 。 在 已有認(rèn)識及本項目其它工作 的基礎(chǔ)上 ，我們將系統(tǒng)地進(jìn)行胰腺和肝臟的 體外重建 研究， Hex、 Ptf1a/p48 和 Pdx1 以及本項目研究中獲得新功能因子 將是這一重建過程研究中的首選 因子。 2） 在體外誘導(dǎo)爪蟾胚胎多能性前體細(xì)胞形成胰腺及真正成熟的胰島 β 細(xì)胞的研究。 我們將綜合運用本課題中的所有研究成果 ，在研究胰腺早期發(fā)育機制的基礎(chǔ)上系統(tǒng)地尋找在爪蟾胚胎前體細(xì)胞中重建胰腺發(fā)育及成熟的胰島 β細(xì)胞的最佳方案 ，該方案將隊友的哺乳類胚胎干細(xì)胞形成成熟的胰島 β細(xì)胞具有直接的參考價值 。 17 6. 利用胚胎干細(xì)胞體系研究胰腺細(xì)胞體外分化的分子機理。 1） 分別建立 PDX1 和 NGN3 啟動子驅(qū)動 GFP 和 RFP 表達(dá)的報告體系 。 基于BAC 建立合適的報告體系 pPDX1:GFP 和 pNGN3:RFP，并將分別其導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞，通過篩選得到可以穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。 2） 研究 RA, BMP, FGF 等信號途徑調(diào)控 pdx1 表達(dá)的分子機理 。 A） 目前我們 已有的工作成果表明， activin A 可以高效誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化產(chǎn)生內(nèi)胚層細(xì)胞，這使我們研究內(nèi)胚層向 PDX1+細(xì)胞分化的分子機制成為可能。在此基礎(chǔ)上，通過對不同分化階段中 PDX1 表達(dá)細(xì)胞的表達(dá)譜分析，尋找伴隨PDX1 變化的其他信號分子； B） 在內(nèi)胚層的基礎(chǔ)上，分別用 RA, BMP, FGF等信號分子單獨或互相組合來處理胚胎干細(xì)胞來源的內(nèi)胚層細(xì)胞，通過觀察PDX1 的表達(dá)變化，來研究這些信號分子對胰腺命運 決定 的功能作用。 3） 胰腺前體細(xì)胞的基因表達(dá)譜 分析，胰腺前體細(xì)胞向內(nèi)分泌細(xì)胞分化過程中的信號調(diào)控機制研究 。 A）在胰腺特化的分化階段，分離 PDX1+細(xì)胞，通過基因芯片技術(shù)分析胰腺前體細(xì)胞特征性的基因表達(dá)模式，從而為研究胰腺的 命運決定 提供線索； B）體外培養(yǎng)分選得到的 PDX1+胰腺前體細(xì)胞，進(jìn)行進(jìn)一步的誘導(dǎo)分化，以 Notch 信號通路為線索，檢測不同信號通路對分化得到的內(nèi)、外分泌部細(xì)胞比例的影響，從而分析在內(nèi)、外分泌部命運決定過程中起關(guān)鍵調(diào)控作用的信號通路，并進(jìn)一步分析這些信號通路與 Notch 信號通路的關(guān)系； C）通過對不同分化階段 PDX1 表達(dá)細(xì)胞的表達(dá)譜分析，尋找伴隨NGN3 表達(dá)變化的信號分子，同時分析 Sox9, Foxa2, Hnf6, Tcf2 的表達(dá)情況，從而找到和 NGN3 表達(dá)變化直接相關(guān)的信號通路。 4） 胰內(nèi)分泌前體細(xì)胞的基因表達(dá)譜分析， Ngn3 下游調(diào)控基因的表達(dá)譜分析 。在胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞 命運決定 的相應(yīng)分化階段，分離 NGN3+細(xì)胞，通過基因芯片技術(shù)分析胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞特征性的基因表達(dá)模式，從而為研究胰腺內(nèi)分泌的 命運決定 提供線索。我們將在分化體系中表達(dá) NGN3 的時間段中取不同的時間點，分離 NGN3+細(xì)胞 ,利用 Realtime PCR 技術(shù)對 Sox9, Foxa2, Hnf6, Tcf2 等相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)分析，從而建 立和 NGN3 表達(dá)量變化相伴隨的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)變化譜。 18 7. 具有胰腺 發(fā)育 缺陷的斑馬魚突變體及致變基因的功能機制 研究。 1） 具有胰腺發(fā)育缺陷突變體的表現(xiàn)型 研究。通過檢測內(nèi)胚層及胰腺發(fā)育不同時期的分子標(biāo)記，研究突變體所具有的胰腺發(fā)育缺陷表現(xiàn)型。 2） 導(dǎo)致胰腺發(fā)育缺陷的致變基因 克隆及其調(diào)控胰腺發(fā)育的分子機理研究 。 A）同 全基因組 多型性標(biāo)記（ polymorphic marker） 掃描 、 細(xì)菌人工染色體（ bacterial artificial chromosome， BAC）克隆 重疊群（ contig） 的建立、零重組多型性標(biāo)記的獲得 、候選致變基因的測序等過程定位和克隆致變 基因 ； B）利用 特異性的 morpholino 和 mRNA 回救以 確 證致變 基因 ，研究其表達(dá)模式；C） 運用細(xì)胞移植 技術(shù) 研究 致變 基因 調(diào)控 胰腺發(fā)育 功能的 細(xì)胞自主（ autonomous） 或 非自主（ nonautonomous） 性 ，如果是非自主的 ，確定調(diào)控 胰腺發(fā)育 的致變基因表達(dá)組織； D） 采用酵母雙雜交、 抗體制備、免疫 共沉淀 、染色質(zhì)免疫共沉淀 等方法深入研究該基因調(diào)控胰腺發(fā)育的分子機 理 。 8. 分離小鼠內(nèi)胚層組織的成體干細(xì)胞，確定干細(xì)胞的分化途徑以及分化的子代細(xì)胞譜。 1） 利用三維培養(yǎng)體系，從小鼠 胚胎和新生小鼠體內(nèi)分離和富 集 內(nèi)胚層組織的干細(xì)胞 /前體細(xì)胞，確定其表面標(biāo)記。 分離小鼠胚胎和新生小鼠的 多種 內(nèi)胚層組織的細(xì)胞，接種到由本課題組發(fā)展的三維細(xì)胞培養(yǎng)體系中，培養(yǎng) 7 天，通過細(xì)胞表面的標(biāo)記，進(jìn)行分選，分選出不同的早期細(xì)胞，在體外誘導(dǎo)分化，確定干細(xì)胞 /祖細(xì)胞。 2） 分析成體小鼠內(nèi)的干細(xì)胞 /前體細(xì)胞組分。 利用流式細(xì)胞儀，分析所獲得的干細(xì)胞 /祖細(xì)胞的表面標(biāo)志，明確干細(xì)胞 /祖細(xì)胞的特異分選標(biāo)記。 3） 分析 內(nèi)胚層組織 干細(xì)胞 /前體細(xì)胞的 特異 基因表達(dá)模式，確定干細(xì)胞 /前 體 細(xì)胞內(nèi)特異基因表達(dá) 。 利用細(xì)胞分選標(biāo)記，分選從小鼠胚胎、新 生小鼠及成體小鼠的內(nèi)胚層組織中分離出干細(xì)胞 /祖細(xì)胞群，提取 mRNA，進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，與分化的細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)譜進(jìn)行對比，確定干細(xì)胞 /祖細(xì)胞內(nèi)的 19 特異表達(dá)的基因，通過進(jìn)一步的 RTPCR 和蛋白檢測，明確內(nèi)胚層干細(xì)胞 /祖細(xì)胞內(nèi)的特異基因表達(dá)。 4） 建立體外干細(xì)胞 /前體細(xì)胞分化體系 ， 確定內(nèi)胚層 組織的 細(xì)胞分化譜 。確定內(nèi)胚層 組織的 細(xì)胞分化譜。 在體外建立內(nèi)胚層細(xì)胞分化培養(yǎng)體系，應(yīng)用生長因子和小分子誘導(dǎo)干細(xì)胞 /祖細(xì)胞定向分化形成消化道、肝或肺等內(nèi)胚層細(xì)胞。建立內(nèi)胚層細(xì)胞分化體系，確定細(xì)胞的分化過程與不同細(xì)胞分化的階段的表面 標(biāo)志。 5） 建立體內(nèi)細(xì)胞分化測定體系，確定體內(nèi)分化 細(xì)胞 譜，比較體內(nèi)外分化譜的異同，明確 內(nèi)胚層組織的 細(xì)胞分化測定手段 。 將從小鼠胚胎、新生小鼠和成體小鼠體內(nèi)分離的干細(xì)胞 /祖細(xì)胞，注射到小鼠的胚胎內(nèi)，跟蹤細(xì)胞的分化，確定體內(nèi)細(xì)胞的分化譜。 9. 在小鼠胚胎發(fā)育過程中，確定小鼠內(nèi)胚層組織的干細(xì)胞 /祖細(xì)胞的形成、分化的子代細(xì)胞譜與分化途徑，探索內(nèi)胚層組織的構(gòu)筑。 1） 標(biāo)記內(nèi)胚層特異表達(dá)基因，在成體 內(nèi)胚層組織 內(nèi)確定基因表達(dá)譜的特異性 ?？寺∫延械墓ぷ髦写_定的與消化道、肝及肺等內(nèi)胚層組織器官基因，制備探針，在成體小鼠體內(nèi)，確定探針的特 異性。 2） 分離小鼠器官形成期的胚胎，確定特異基因在小鼠胚胎中的組織特異性 。 3） 篩選內(nèi)胚層分化過程中的 特異表達(dá)的基因 。 應(yīng)用測定的特異探針，與分離的器官形成期胚胎進(jìn)行雜交，確定在胚胎發(fā)育中，內(nèi)胚層器官起源的細(xì)胞，跟蹤細(xì)胞的分化和發(fā)育，確定器官的早期構(gòu)筑與結(jié)構(gòu)。 4） 分離 單 細(xì)胞到器官形成期的小鼠胚胎， 對 胚胎內(nèi)胚層 細(xì)胞進(jìn)行譜系定位 ，為系統(tǒng)分析小鼠內(nèi)胚胎發(fā)育提供基礎(chǔ) 。 應(yīng)用測定的內(nèi)胚層組織的干細(xì)胞特異探針，與分離的單個 細(xì)胞到器官形成期的小鼠胚胎 進(jìn)行雜交，確定在胚胎發(fā)育中，內(nèi)胚層組織起源的細(xì)胞，跟蹤細(xì)胞的分化和發(fā)育，內(nèi)胚層組織早 期構(gòu)筑與結(jié)構(gòu)。 20 10. 建立內(nèi)胚層組織特異基因條件 敲除 小鼠， 標(biāo)記內(nèi)胚層組織起源細(xì)胞， 分析內(nèi)胚層組織的形成與構(gòu)筑的過程，探討內(nèi)胚層組織形成的分子機制。 1） 確定內(nèi)胚層發(fā)育的特異基因 。 確定本項目組內(nèi)在早蟾和斑馬魚內(nèi)克隆的內(nèi)胚層發(fā)育的特異基因，與小鼠體內(nèi)確定的基因進(jìn)行比較，明確在分化與發(fā)育過程中， 發(fā)揮 重要作用的基因譜。 確定內(nèi)胚層早期形成中的靶基因。 2） 構(gòu)建條件性基因打靶的 ES 細(xì)胞 ， 體外分析細(xì)胞的分化能力 。 克隆特異的內(nèi)胚層形成的靶基因片段，將 LacZ 和 GFPcDNA 插入到靶基因的 ATG 后面，用 LoxP 片段一起可以被切割的 DNA 片段， 構(gòu)建條件性基因打靶 的載體，并將該載體轉(zhuǎn)入 的 小鼠 ES 細(xì)胞 ，篩選同源重組的 ES 細(xì)胞，分離純化同源重組的 ES 細(xì)胞，建立細(xì)胞克隆。并在體外建立分化體系，確定 ES 細(xì)胞的分化能力，和內(nèi)胚層形成的體外過程。 3） 構(gòu)建條件基因打靶小鼠。 將同源重組的 ES 細(xì)胞注射到小鼠的囊胚中，構(gòu)建嵌合體小鼠，經(jīng)傳代形成基因打靶小鼠。利用 LacZ 和 GFP 標(biāo)記內(nèi)胚層早期的細(xì)胞，在胚胎發(fā)育中跟蹤細(xì)胞的分化過程。 4） 分析內(nèi)胚