【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 下適應(yīng)高鹽或低溫逆境的分子調(diào)控途徑。 擬選擇的資源植物材料主要包括：以我國(guó)特有的野生稻資源（如江西東鄉(xiāng)野生稻等）作為禾本科植物的野生代表材料，以生長(zhǎng)在我國(guó)沿海鹽堿灘涂和新疆戈壁灘的小鹽芥 （ Thellungiella halophila）及我國(guó)特有的分布在西藏和新疆等特殊生境條件下的不同生態(tài)型擬南芥（ Arabidopsis thaliana） 作為雙子葉植物的野生代表材料 。 小鹽芥是與模式植物擬南芥同屬十字花科的高度耐鹽（ ?300 mM NaCl）野生植物，具有基因組?。▋H是擬南芥基因組的約 2 倍）、生活周期短等與擬南芥極為相似的特點(diǎn)。而采集自我國(guó)西藏、新疆等地的擬南芥生態(tài)型則由于其生活環(huán)境的特殊，很可能具有一些特別重要的抗逆基因資源。我國(guó)江西東鄉(xiāng)的野生稻具有特別耐寒的優(yōu)良性狀，是克隆重要耐寒基因及研究植物應(yīng)答低溫脅迫的很 好野生植物資源。 課題組成員已經(jīng)取得的前期研究結(jié)果主要有：（ 1） 已經(jīng)完成了對(duì)不同生態(tài)型小鹽芥（山東、新疆、加拿大）的收集與生長(zhǎng)、發(fā)育及逆境應(yīng)答特性的觀測(cè)和評(píng)估。其中，山東生態(tài)型小鹽芥（ 2 個(gè)）主要表現(xiàn)耐鹽性狀；新疆生態(tài)型小鹽芥主要表現(xiàn)耐干旱性狀；加拿大生態(tài)型小鹽芥主要表現(xiàn)耐低溫和干旱的性狀。 已獲得不同生態(tài)型小鹽芥的雜交后代分離群體； 建立了小鹽芥的基因轉(zhuǎn)化技術(shù)方法 。 構(gòu)建了小鹽芥 cDNA文庫(kù)并進(jìn)行了隨機(jī)克隆測(cè)序，已完成 5000余條鹽誘導(dǎo) EST 的測(cè)序及獲得了數(shù)百條受鹽脅迫誘導(dǎo)的基因的全長(zhǎng) cDNA。應(yīng)用化學(xué)誘變（ EMS）和 TDNA 插入方法分別獲得一批突變體 。還利用小鹽芥 完成了其基因表達(dá)譜（利用擬南芥基因芯片）的分析，發(fā)現(xiàn)了一些可能與其高度耐鹽性狀相關(guān)的基因表達(dá)譜信息，并利用 PathwayAssist 網(wǎng)絡(luò)分析軟件構(gòu)建了小鹽芥響應(yīng)高鹽脅迫的部分基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)工作模型（見(jiàn)附圖）等。（ 2）已搜集了十多個(gè)分布在我國(guó)新疆、西藏等特殊生態(tài)環(huán)境下的擬南芥生態(tài)型，并已開(kāi)展了與經(jīng)典擬南芥生態(tài)型（ Col）的比較基因組研究及耐鹽、耐低溫表型比較分析等。（ 3）利用江西東鄉(xiāng)野生稻與栽培稻雜交獲得的基因滲入品系，對(duì)其基因表達(dá)譜與栽培稻進(jìn)行比較分 析，已獲得了一些有意義的結(jié)果。 例如：對(duì)一表現(xiàn) 顯著 耐低溫 性狀 的 基因滲入 材料的基因表達(dá)譜與 栽培稻 基因表達(dá)譜的生物信息學(xué)比較分析結(jié)果表明，可能雜交滲入品系的耐低溫性狀與一個(gè) 與氧化脅迫相關(guān) 基因的可變剪切表達(dá)型式發(fā)生變化相關(guān)。 課題擬開(kāi)展的研究工作內(nèi)容主要包括：（ 1） 利用野生稻和栽培稻雜交選育的滲入品系，從中篩選出一些具有明顯 耐低溫、耐鹽的 材料；利用 Affymetrix最新的水稻全基因組芯片對(duì)這些 滲入品系 進(jìn)行表達(dá)譜分析，結(jié)合對(duì)親本和雜交后代的基因型分析、驗(yàn)證，鑒別出 與耐低溫、耐鹽等 抗逆表型密切相關(guān)的基因 ，并對(duì)其中的重 要新基因進(jìn)行功能和表達(dá)調(diào)控分析； （ 2）根據(jù)小鹽芥與擬南芥基因表達(dá)譜的比較分析，克隆由鹽脅迫特異誘導(dǎo)的、可能與小鹽芥的特殊耐高鹽性狀密切相關(guān)的一些基因，如 ATHB7 和 NAC 等編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因及表達(dá)受這些轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的一些重要基因 KIN KIN COR4 COR78（ RD29A）、 LTI65（ RD29B） 等 （見(jiàn)附圖）；（ 3）利用 小鹽芥 和野生稻的 EMS誘變 或 TDNA 插入突變體庫(kù) 篩選高度耐鹽或?qū)}脅迫高度敏感 、耐低溫 的突變體，并進(jìn)行基因克隆與基因功能分析；（ 4）利用生活在不同極端生態(tài)環(huán)境條件下 （低溫、鹽堿 、高海拔） 的不同生態(tài)型擬南芥 及其雜交后代 篩選高度耐鹽或?qū)}脅迫高度敏感 、耐低溫 的 株系 并進(jìn)行基因 的 克隆與功能分析 等；（ 4）、與課題 5 合作，通過(guò)基因表達(dá)譜比較分析，研究小鹽芥與擬南芥、不同生態(tài)型擬南芥之間應(yīng)答高鹽、低溫脅迫的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制。 課題預(yù)期目標(biāo)： 自特殊生境野生資源植物中克隆 10 個(gè)以上重要耐鹽、耐低溫新功能基因， 為今后應(yīng)用 基因工程技術(shù)進(jìn)行作物抗逆性改良的 分子 設(shè)計(jì)育種提供有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的重要功能基因；闡明 12 條特殊生境植物應(yīng)答高鹽、低溫脅迫的分子調(diào)控途徑，并與課題 5 合作，分析不同植物應(yīng)答高鹽、低溫脅迫的分子調(diào)控機(jī)制的異同，并期望從中發(fā)現(xiàn)開(kāi)展進(jìn)一步研究的重要信息。 申請(qǐng)發(fā)明專利 8?10 項(xiàng)；發(fā)表 SCI 論文 15 篇 （ 其中影響因子 大于 5的論文 4 篇 以上） 。培養(yǎng)博士后 2 人、博士及碩士研究生 15 人。 課題負(fù)責(zé)人： 趙彥修 承擔(dān)單位： 山東 師范大學(xué)， 北京大學(xué) 主要學(xué)術(shù)骨干： 趙彥修，張慧，范六民 專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)比例： % 課題 植物應(yīng)答高鹽、低溫脅迫的分子 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制 研究 根據(jù)本項(xiàng)目前期研究結(jié)果和 擬 重點(diǎn) 開(kāi)展的 研究?jī)?nèi)容，結(jié)合基因組學(xué)、分子生物學(xué)在植物逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與基因表達(dá)調(diào)控方面的已有成果和數(shù)據(jù)庫(kù)信息，利用生物 信息學(xué)的理論與方法，圍繞本項(xiàng)目重點(diǎn)內(nèi)容研究植物 應(yīng)答鹽堿、低溫脅迫的分子 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制 。 本課題的工作流程見(jiàn)下頁(yè)附圖， 具體研究?jī)?nèi)容包括： （ 1）基于基因芯片、 cDNA 微陣列及已發(fā)表文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)庫(kù)，以模式植物擬南芥和水稻逆境相關(guān)基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)和基因功能研究結(jié)果為重點(diǎn)，構(gòu)建植物耐鹽、耐低溫等抗逆性狀相關(guān)的 基因數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)對(duì)大規(guī)?；虮磉_(dá)譜的分析，尋找未知的與逆境反應(yīng)相關(guān)的基因及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑，運(yùn)用系統(tǒng)方法（全基因組定位分析、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等）和計(jì)算機(jī)算法（貝葉斯網(wǎng)絡(luò)模型、基因調(diào)控模塊等）建立植物應(yīng)答高鹽、低溫等脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型（目前已經(jīng)構(gòu)建的植物應(yīng)答高鹽、低溫等脅迫的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型見(jiàn) 以下 附圖 ，應(yīng)用美國(guó) Stratagene 的網(wǎng)絡(luò)分析軟件 PathwayAssist分析得出的模型 ）；同時(shí)根據(jù)本項(xiàng)目及國(guó)內(nèi)外他人的新研究進(jìn)展對(duì)提出的網(wǎng)絡(luò)模型不斷修改、調(diào)整和補(bǔ)充；（ 2）通過(guò)拓樸分析，篩選出處 于上述網(wǎng)絡(luò)模型中各子網(wǎng)絡(luò)中心的節(jié)點(diǎn)和處于關(guān)鍵連接位置的節(jié)點(diǎn)以及與之相關(guān)的基因信息，建立新的信號(hào)傳遞途徑工作模型，提出本項(xiàng)目課題 4 擬進(jìn)一步進(jìn)行生物學(xué)研究的方案；進(jìn)而根據(jù)項(xiàng)目其它課題的研究結(jié)果不斷完善植物應(yīng)答高鹽、低溫的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；（ 3） 應(yīng) 用比較基因組研究分析手段，利用模式植物擬南芥和水稻的全基因組信息以及其它作物（小麥、玉米、棉花、大豆、油菜等） 的 已知 信息 ，尋找不同作物種類中的同源抗逆基因，預(yù)測(cè)并驗(yàn)證植物抗逆關(guān)鍵基因在作物抗逆中的功能 及生物學(xué)效應(yīng) 。 課題預(yù)期目標(biāo)： 通過(guò) 對(duì) 基因組 和文獻(xiàn) 數(shù)據(jù) 庫(kù)信息的 挖 掘 、分析 和整合， 結(jié)合本項(xiàng)目各課題組研究結(jié)果和進(jìn)展， 運(yùn)用系統(tǒng)方法和計(jì)算機(jī)算法，建立植物應(yīng)答高鹽、低溫等脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型 并不斷予以修改調(diào)整 ；分析篩選出 810 個(gè)處于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中心位置和關(guān)鍵連接位置的節(jié)點(diǎn)及與之相關(guān)的重要新基因，并與課題 4 合作完成生物學(xué)驗(yàn)證工作；力爭(zhēng)在建立 23 條有明顯創(chuàng)新性的植物應(yīng)答高鹽、低溫等脅迫的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)途徑方面有所突破。發(fā)表 SCI 論文 10 篇（其中影響因子大于 5 的論文 4 篇以上）。培養(yǎng)博士后 2 人、博士及碩士研究生 10 人。 課題負(fù)責(zé)人： 蘇震 承擔(dān)單位：中國(guó)農(nóng) 業(yè)大學(xué)，中科院遺傳所 主要學(xué)術(shù)骨干：蘇震、 徐文英 、閻紅 專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)比例： % 課題 重要耐鹽、耐低溫基因的生物學(xué)整合效應(yīng)分析研究 本課題擬通過(guò) 對(duì)根組織、葉片或氣孔中特異表達(dá)和在 鹽、低溫等 非生物 逆境下特異誘導(dǎo) 表達(dá)的啟動(dòng)子進(jìn)行分析和改造，以期實(shí)現(xiàn)對(duì)一些與作物耐鹽、耐低溫等抗逆性狀密切相關(guān)的重要功能基因或調(diào)控因子進(jìn)行合理的分子操控（基因重組），以有效地實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)抗逆相關(guān)主效基因時(shí)空特異表達(dá)的操縱，為作物抗逆性狀改良的分子育種設(shè)計(jì)提供可行的理論與技術(shù)指導(dǎo)。特別注重轉(zhuǎn)基因作物生物學(xué)整合效應(yīng)的分析，以實(shí)現(xiàn)在 不影響作物其它優(yōu)良農(nóng)藝性狀的前提下較大幅度提高作物 耐鹽、耐低溫性狀 的目的。主要研究?jī)?nèi)容包括： 逆境特異誘導(dǎo)型和組織特異表達(dá)型啟動(dòng)子的分析與構(gòu)建：（ 1）轉(zhuǎn)錄水平特異啟動(dòng)子的鑒定和分析：通過(guò)對(duì)高鹽和低溫條件下擬南芥和水稻不同器官和特定細(xì)胞類型（包括幼苗、根、葉、幼穗、花粉和保衛(wèi)細(xì)胞）中基因表達(dá)譜的 DNA 芯片分析，鑒定組織特異表達(dá)且受高鹽和 /或低溫特異誘導(dǎo)的候選基因；通過(guò)生物信息學(xué)方法分析和鑒定控制這些基因表達(dá)的特異啟動(dòng)子。（ 2）轉(zhuǎn)譯水平特異啟動(dòng)子的鑒定和分析：用 NASC (Nottingham Arabidopsis Stock Centre)的 GUS 啟動(dòng)子捕捉群體篩選組織特異及高鹽和低溫特異誘導(dǎo)的候選啟動(dòng)子，利用標(biāo)簽信息克隆這些啟動(dòng)子、并用信息學(xué)方法進(jìn)行分析和鑒定。通過(guò)以上兩方面的鑒定，對(duì)部分?jǐn)M南芥和水稻中的組織特異及高鹽和低溫特異誘導(dǎo)的啟動(dòng)子進(jìn)行改造（如增強(qiáng)子的添加、組織特異及逆境特異誘導(dǎo)調(diào)控元件的融合等），然后用啟動(dòng)子功能高通量檢測(cè)載體分析改造后啟動(dòng)子調(diào)控基因表達(dá)的效果。 多基因遺傳轉(zhuǎn)化方案及轉(zhuǎn)基因作物生物學(xué)效應(yīng)研究：利用 Gateway 重組技術(shù)將多個(gè)（如 35 個(gè)）與耐鹽、耐低溫等抗逆性狀密切相關(guān)的基 因同時(shí)與上述鑒定的組織特異及高鹽或低溫特異誘導(dǎo)的啟動(dòng)子融合，轉(zhuǎn)化水稻或擬南芥。同時(shí)，分別將每個(gè)基因分別與各自特異的啟動(dòng)子融合，用構(gòu)建的多個(gè)載體同時(shí)轉(zhuǎn)化水稻或擬南芥。對(duì)以上兩種方法獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行生物學(xué)效應(yīng)（耐鹽或耐低溫性狀）分析，并進(jìn)一步在水稻、玉米、棉花或番茄等作物中進(jìn)行驗(yàn)證，探討作物抗逆性與基因協(xié)同效應(yīng)的關(guān)系。 本課題研究工作的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)：利用多種手段研究組織特異性及高鹽或低溫誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，構(gòu)建“智慧型”表達(dá)模式啟動(dòng)子，以達(dá)到調(diào)控抗逆基因適時(shí)、適地、適量表達(dá)，以達(dá)到 在不影響作物其它優(yōu)良農(nóng)藝性狀的前提 下，為較大幅度提高作物抗逆性的分子改良技術(shù)提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支撐的目的。 課題預(yù)期目標(biāo)： 分離鑒定并構(gòu)建 45 個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的作物根組織、葉片組織或氣孔細(xì)胞特異表達(dá)、高鹽或低溫特異誘導(dǎo)的啟動(dòng)子；用啟動(dòng)子缺失與突變技術(shù)分離鑒定調(diào)控抗逆基因表達(dá)的順式作用元件 23 組；建立作物多基因遺傳轉(zhuǎn)化和啟動(dòng)子調(diào)控技術(shù)體系。申請(qǐng)發(fā)明專利 45 項(xiàng)，發(fā)表 SCI 論文 15篇以上（其中影響因子大于 5 的論文 4 篇以上），培養(yǎng)博士后 2 人、博士研究生 10 人。 課題負(fù)責(zé)人 ：王學(xué)臣 承擔(dān)單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 主要 學(xué)術(shù)骨干 ：王學(xué)臣、鄭 成超，王喜慶 專項(xiàng) 經(jīng)費(fèi)比例： % 四、年度計(jì)劃 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 一 年 第 6課題全面啟動(dòng)實(shí)驗(yàn)工作。主要研究?jī)?nèi)容包括：利用已有突變體和轉(zhuǎn)基因植物材料克隆相關(guān)基因及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子等；構(gòu)建必要的新實(shí)驗(yàn)材料等。具體包括： 蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)的方法尋找與逆境脅迫相關(guān)的質(zhì)外體多肽與質(zhì)膜蛋白（受體激酶）；克隆新的細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白基因；擬南芥 PLD突變體耐鹽性鑒定，野生型與突變體耐鹽生理機(jī)制研究。磷脂信號(hào)在 NaCl和 ABA誘導(dǎo)的氣孔運(yùn)動(dòng)中的作用與分子機(jī)理研究。開(kāi)始水稻 耐低溫材料的篩選；篩選 TDNA插入及 EMS誘變的PKS5突變體，對(duì)其進(jìn)行表型分析；通過(guò)real time PCR等方法不同亞型 CaM在逆境脅迫下的表達(dá)變化； PKS5突變體的篩選、鑒定和表型分析； PKS5各突變蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建。 篩選大豆應(yīng)答鹽、低溫脅迫的轉(zhuǎn)錄因子；運(yùn)用酵