【正文】 完成研究計(jì)劃 ，總結(jié)研究數(shù)據(jù)和成果，為進(jìn)一步的深入研究打下堅(jiān)實(shí) 的基礎(chǔ) ；發(fā)表 12－ 14 篇 SCI學(xué)術(shù)論文，其中影響因子大于 5 的4－ 6 篇 、影響因子大于 10 的 3 篇；申請(qǐng)專利 2－ 4 個(gè)。 闡明 早期預(yù)定前體細(xì)胞差異表達(dá)基因的功能機(jī)制；完成 在體外誘導(dǎo)爪蟾胚胎多能性前體細(xì)胞形成胰腺 的 研究；闡明 RA 及協(xié)同因子促進(jìn) 胰腺 分化的分子機(jī)理；利用條件基因打靶小鼠 研究 內(nèi)胚層發(fā)育的分子機(jī)制 。 具有肝臟 和胰腺的發(fā)育和再生缺陷突變體致變基因的功能機(jī)制研究； SB 轉(zhuǎn)座子介導(dǎo) 的 突變體 致變基因的功能機(jī)制研究。 第 五 年 早期不同預(yù)定前體細(xì)胞差異表達(dá)基因的功能機(jī)制研究； 新功能基因調(diào)控肝臟發(fā)育的分子機(jī)理研究； 總結(jié)胚胎干細(xì)胞向向肝細(xì)胞 的分化條件和 機(jī)制 ； 代表性表觀遺傳位點(diǎn)附近基因調(diào)控肝臟發(fā)育的分子機(jī)理研究；K63 多 泛素 化蛋白 及 NEMO/IKK?的泛素化 調(diào)控肝臟發(fā)育的分子機(jī)理研究。 完成 肝臟 和胰腺的發(fā)育和再生缺陷的突變體表現(xiàn)型分析和致變基因的克??；初步闡明 SB 轉(zhuǎn)座子介導(dǎo) 突變體 致變基因的功能機(jī)制；闡明 Tol2 增強(qiáng)子誘捕品系中 目標(biāo)基因的功能機(jī)制。 初步闡明 早期不同預(yù)定前體細(xì)胞差異表達(dá)基因的功能及機(jī)制；初步闡明 新功能基因調(diào)控肝臟發(fā)育的分子機(jī)理研究；闡明 調(diào)控 肝臟前體細(xì)胞 向不同譜系分化的關(guān)鍵信號(hào)通路 ； 闡明 肝細(xì)胞 特異 性 組蛋白 H3 N 端 三甲基化酶 調(diào)控 肝細(xì)胞分化 的分子機(jī)制；初步闡明代表性表觀 遺傳位點(diǎn)附近基因調(diào)控肝臟發(fā)育的分子機(jī)理；闡明突變體致變基因調(diào)控肝臟發(fā)育的分子機(jī)理；初步闡明K63 多 泛素化蛋白 及 NEMO/IKK?的泛素化 調(diào)控肝臟發(fā)育的分子機(jī)理。 早期胰內(nèi)外分泌腺預(yù)定前體細(xì)胞差異表達(dá)基因的功能機(jī)制研究；Hex 靶基因及其相互作用因子 介導(dǎo)Hex 對(duì)胰腺發(fā)育調(diào)控作用的分子機(jī)理研究； 爪蟾胚胎胰腺和肝臟的體外重建 研究； 尋找與 RA 協(xié)同誘導(dǎo)內(nèi)胚層向胰腺前體細(xì)胞分化的因子，根據(jù)芯片結(jié)果和表面標(biāo)志表達(dá)對(duì)胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞進(jìn)行分群并對(duì)不同細(xì)胞群進(jìn)行功能評(píng)價(jià) ； 導(dǎo)致胰腺發(fā)育缺陷的斑馬魚突變體致變基因的功能機(jī)制研究；內(nèi)胚層特 異表達(dá)基因發(fā)揮功能的分子機(jī)制研究； 構(gòu)建條件基因打靶小鼠 ， 利用 LacZ 和 GFP 標(biāo)記內(nèi)胚層早期 細(xì)胞 以跟蹤細(xì)胞 分化過程。 完成研究計(jì)劃；發(fā)表 9－ 11篇 SCI 學(xué)術(shù)論文，其中影響因子大于 5 的 4 篇 、影響因子大于 10 的 1－ 2 篇；申請(qǐng)專利 1 個(gè)。 以正向遺傳突變篩選獲得具有 肝臟或胰腺發(fā)育 或再生 缺陷的突變體 ； 完成研究計(jì)劃； 完成 SB 轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的 突變體的表現(xiàn)型 分析和保持系的建立 ；初步闡明 Tol2 增強(qiáng) 30 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 系統(tǒng)和熒光篩選具有肝臟或胰腺再生缺陷的突變體； SB 轉(zhuǎn)座子介導(dǎo) 的 突變體的表現(xiàn)型分析和保持系的建立 ；Tol2 增強(qiáng)子誘捕品系中 調(diào)控 胰腺發(fā)育 功能基因的 細(xì)胞自主 性及功能機(jī)制研究。 根據(jù)熒光篩選 具有肝臟或胰腺的發(fā)育缺陷的突變體 ； 利用 NTRMtz完成 不同預(yù)定前體細(xì)胞差異表達(dá)基因的表現(xiàn)型研究；研究 新功能基因調(diào)控肝臟發(fā)育的分子機(jī)理；獲得肝臟前體細(xì)胞的表面分子標(biāo)記；闡述 肝細(xì)胞 特異 性 組蛋白 H3 N端 三甲基化酶在肝細(xì)胞形成與分化中的 功能；完成斑馬魚代表性表觀遺傳位點(diǎn)附近基因的克隆及表現(xiàn)型研究；完成具有肝臟發(fā)育缺陷突變體的致變基因確認(rèn)及自主性研究；闡明 NEMO/IKK?的泛素化水平及在 不同發(fā)育時(shí)期肝臟 中 的變化；初步闡明 Wnt 及 KLP 調(diào)控肝臟發(fā)育的分子機(jī) 理 。 第 三 年 早期不同預(yù)定前體細(xì)胞差異表達(dá)基因的表現(xiàn)型研究 ；新功能基因調(diào)控肝臟發(fā)育的分子機(jī)理研究； 通過基因芯片分析尋找肝臟前體細(xì)胞的表面分子標(biāo)記 ； 肝細(xì)胞 特異 性 組蛋白 H3 N 端 三甲基化酶在肝細(xì)胞形成與分化中的作用與分子 機(jī)理研究；代表性表觀遺傳位點(diǎn)附近基因的克隆及其在肝臟發(fā)育中的表達(dá)和表現(xiàn)型研究；導(dǎo)致肝臟發(fā)育缺陷的斑馬魚突變體致變基因的確認(rèn)、自主性及功能機(jī)制研究； NEMO/IKK?的泛素化水平及 在 不同發(fā)育時(shí)期肝臟 中 的變化； Wnt 信號(hào)途徑及 KLP 調(diào)控肝臟發(fā)育的分子機(jī)理研究 。 子誘捕 品系 的 候選基因表現(xiàn)型及細(xì)胞內(nèi)定位研究。 獲得最佳的 Mtz 濃度和處理時(shí)間，闡明再生的細(xì)胞過程；獲得三轉(zhuǎn)基因系 pilGRenN 純合子；基本完成 SB 轉(zhuǎn)座子誘導(dǎo)的 卵子基因組的活體 誘 變及肝臟、 胰臟 、腸道發(fā)育突變體的篩選 ；完成 Tol2 增強(qiáng) 29 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 小鼠胚胎 中的內(nèi)胚層發(fā)育過程。 用內(nèi)胚層特異性基因的原位雜交跟蹤從單 細(xì)胞到器官形成期的完成 肝臟 和腸道 前體細(xì)胞 之間及其分別與原腸中末期內(nèi)胚層細(xì)胞 差異表達(dá)基因的芯片篩選 和表達(dá)模式研究；完成 肝臟發(fā)育不同時(shí)期差異表達(dá)的新基因 的表達(dá)和表現(xiàn)型研究；完成 干細(xì)胞來源的肝臟前體細(xì)胞的基因表達(dá)特性 篩選；完成 肝細(xì)胞 組蛋白 H3 N 端三甲基化 的表觀遺傳穩(wěn)定研究和特異三甲基化酶的克??；確定 代表性表觀遺傳位點(diǎn)在 斑馬魚 肝臟發(fā)育中的功能 ； 克隆具有肝臟發(fā)育缺陷的斑馬魚突變體的致變基因 ；完成 NEMO/IKK?及K63 多 泛素化蛋白 在肝臟發(fā)育 中的表現(xiàn)型 研究 。 第 二 年 4－ 6 體節(jié)時(shí)期 斑馬魚預(yù)定的肝臟 和腸道 前體細(xì)胞 分選， 兩 者 之間及其分別與原腸中末期內(nèi)胚層細(xì)胞 差異表達(dá)基因的芯片篩選 和表達(dá)模式研究； 芯片篩選所獲新基因 在 肝臟發(fā)育 中的表達(dá)和 表現(xiàn)型研究；通過基因芯片分析胚胎干細(xì)胞來源的肝臟前體細(xì)胞的基因表達(dá)特性； 肝細(xì)胞特異的組蛋白 H3 N端三甲基化酶的克隆，H3 N 端三甲基化在從胚胎干細(xì)胞到肝細(xì)胞分化過程中的表觀遺傳穩(wěn)定性及功能的系統(tǒng)研究；代表性表 觀遺傳位點(diǎn)在肝臟發(fā)育中的功能研究；克隆具有肝臟發(fā)育缺陷的斑馬魚突變體的致變基因； NEMO/IKK?及 K63多 泛素化蛋白 在肝臟發(fā)育 中的 表現(xiàn)型 研究； Wnt 信號(hào)途徑及 KLP 調(diào)控肝臟發(fā)育的分子機(jī)理研究 。 完成研究計(jì)劃；發(fā)表 3－ 5 篇SCI 學(xué)術(shù)論文，其中影響因子大于5 的 1－ 2 篇 ，影響因子大于 10 的 0－ 1 篇。 篩選出 非洲爪蟾 預(yù)定的胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞 特異 性調(diào)控因子 ；獲得并確證與 Hex 相結(jié)合的蛋白 因子 ；完成 大規(guī)模整體原位雜交 并獲得 胰腺特異性表達(dá)的新基因 ； 完成研究計(jì)劃； 建立比較完善的 由 干細(xì)胞向胰腺 β細(xì)胞的分化體系和 NGN3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng) 報(bào)告 基因 的 干細(xì)胞系 ；闡明 具有 胰腺 發(fā)育缺陷的斑馬魚突變體的表現(xiàn)型 ； 建立體外干細(xì)胞 /前體細(xì)胞分化體系 ， 確定內(nèi)胚層 組織的細(xì)胞分化譜 ； 標(biāo)記內(nèi)胚層特異表達(dá)基因 并在成體組織中 確定基因表達(dá)的特異性 。 非洲爪蟾 預(yù)定的胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞 特異性調(diào)控因子的篩選 ； 篩選與Hex 相結(jié)合的蛋白因子，確證它們的直接相互作用 ； 利用大規(guī)模整體原位雜交從非洲爪蟾胚胎及成體的胰腺cDNA 文庫中篩選胰腺特異性表達(dá)的新基因 ； 建立比較完善的胚胎干細(xì)胞向胰腺 β細(xì)胞的分化體系和 NGN3啟動(dòng)子驅(qū) 動(dòng)的報(bào)告體系的胚胎干細(xì)胞系 ； 研究具有 胰腺 發(fā)育缺陷的斑馬魚突變體的表現(xiàn)型 ； 從 小鼠胚胎和新生小鼠體內(nèi)分離和富 集 內(nèi)胚層組織的干細(xì)胞 /前體細(xì) 胞并 建立體外干細(xì)胞 /前體細(xì)胞分化體系 ， 確定內(nèi)胚層 組織的 細(xì)胞分化譜 ； 標(biāo)記內(nèi)胚層特異表達(dá)基因 并在成體組織中 確定基因表達(dá)的特異性 。 主要目標(biāo)： 開展本課題研究工作的主要目標(biāo)是：建立肝臟、 β細(xì)胞 和胰外分泌腺再生的斑馬魚模型；利用 ENU 正向遺傳突變篩選獲得具有 肝臟、 β 細(xì)胞 或胰外分泌腺的發(fā)育或再生缺陷的突變體，并闡明致變基因的功能機(jī)制；利用轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的正 26 向遺傳突變或增強(qiáng)子誘捕獲得具有內(nèi)胚層器官發(fā)育缺陷的突變體，并 闡明致變基因的功能機(jī)制。 3. 通過增強(qiáng)子誘捕獲得的胰腺 GFP 標(biāo)記轉(zhuǎn)基因魚的基因定位、鑒定及功能研究 。 承擔(dān)單位： 中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院、四川大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 陳永龍 經(jīng)費(fèi)比例： 30％ 課題三： 正向遺傳突變篩選具有 內(nèi)胚層器官發(fā)育或再生缺陷的突變體及致變基因的功能機(jī)制研究 主要研究內(nèi)容： 1. 斑馬魚肝臟和胰島 β 細(xì)胞再生模型的建立及 ENU 正向遺傳突變篩選研究在肝臟或胰腺發(fā)育、肝臟或 β細(xì)胞再生過程中發(fā)揮重要功能的基因及其 作用機(jī)制 。 主要目標(biāo)： 本課題以重要的內(nèi)胚層器官胰腺的發(fā)育為主要研究內(nèi)容。 9. 在小鼠胚胎發(fā)育過程中，確定小鼠內(nèi)胚層組 織的干細(xì)胞 /祖細(xì)胞的形成 、 分化的子代細(xì)胞 譜與分化 途徑，探索內(nèi)胚層組織的構(gòu)筑。 7. 具有胰腺 發(fā)育 缺陷的斑馬魚突變體及致變基因的功能機(jī)制 研究。 5. 非洲爪蟾胚胎胰腺和肝臟的體外重建。 3. 非洲爪蟾胰腺特異性表達(dá)的新基因的篩選及功能機(jī)制研究。 24 承擔(dān)單位： 西南大學(xué)、四川大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 羅凌飛 經(jīng)費(fèi)比例： 45％ 課題二：調(diào)控胰腺發(fā)育的分子機(jī)理研究 主要研究內(nèi)容 ： 1. 在 斑馬魚 預(yù)定的 胰內(nèi)外分泌 前體細(xì)胞中 差 異表達(dá)基因 的 篩選及其功能機(jī)制研究。 主要目標(biāo)： 本課題以重要的內(nèi)胚層 器官肝臟和腸道的發(fā)育為主要研究內(nèi)容。 8. NEMO/IKK?的 K63 多泛素化在調(diào)控肝臟發(fā)育中的功能與分子機(jī)理。 6. 表觀遺傳在 斑馬魚 內(nèi)胚層器官發(fā)育的不同階段的穩(wěn)定性及其功能的系統(tǒng)研究。 4. 利用胚胎干細(xì)胞體系研究肝前體及肝細(xì)胞體外分化的分子機(jī)理。 2. 在 斑馬魚 預(yù)定的肝臟 或腸道 前體細(xì)胞中 特異和差 異表達(dá)基因 的 篩選 及其功能機(jī)制研究。 同本課題中第 3 部分的研究方案。 D） 在進(jìn)行 雌核發(fā)育的同時(shí)，將部分 攜帶新遺傳突變的卵細(xì)胞 與野生精子外交以維持品系。 2） 具有肝臟 、胰腺或腸道 發(fā)育缺陷的突變體篩選 。 1） 攜帶 轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因斑馬魚的建立 。 A） 克隆候選基因 并研究其表達(dá)模式， 與相應(yīng)轉(zhuǎn)基因品系的熒光表 達(dá) 相對(duì)應(yīng) ； B）通過熒光融合蛋白確定新基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位； C）研究新基因過表達(dá)或敲降后胰腺 分子標(biāo)記的表達(dá)變化；D） 運(yùn)用細(xì)胞移植 技術(shù) 研究 新 基因 調(diào)控 胰腺發(fā)育 功能的 細(xì)胞自主 或 非自主性 ，如果是非自主的， 確定調(diào)控 胰腺 發(fā)育 的新基因表達(dá)組織 ； F） 采用酵母雙雜交、 抗體制備、免疫 共 沉淀 、染色質(zhì)免疫共沉淀 等方法深入研究 新 基因調(diào)控胰腺發(fā)育的分子機(jī) 理 。 利用LMPCR（ linker mediated PCR）和 基因組數(shù)據(jù)庫 尋找潛在的候選基因。 3. 通過增強(qiáng)子誘捕獲得的胰腺 GFP 標(biāo)記轉(zhuǎn)基因魚的基因定位、鑒定及功能研究 。 建立 elastase:DenNTR 轉(zhuǎn)基因系研究胰外分泌腺再生的細(xì)胞過程，并以此轉(zhuǎn) 22 基因系為載體開展 ENU 正向遺傳突變篩選。我們將通過生殖細(xì)胞移植技術(shù)建立母源－配子突變體（ maternalzygotic mutant），研究母源性因子功能缺失后對(duì)肝臟或者 β細(xì)胞 的發(fā)育特別是對(duì)早期細(xì)胞分化的影響及其作用機(jī)制。 A）同 全基因組 多型性標(biāo)記（ polymorphic marker） 掃描 、 細(xì)菌人工染色體（ bacterial artificial chromosome， BAC）克隆 重疊群（ contig） 的建立、零重組多型性標(biāo)記的獲得 、候選致變基因的測(cè)序等過程定位和克隆致變 基因 ； B）利用 特異性的 morpholino 和 mRNA 回救以 確 證致變 基因 ，研究其表達(dá)模式； C） 運(yùn)用細(xì)胞移植 技術(shù) 研究 致變 基因調(diào)控 胰腺發(fā)育 功能的 細(xì)胞自主（ autonomous） 或 非自主（ nonautonomous）性 ，如果是非自主的 ，確定調(diào)控 胰腺發(fā)育 的致變基因表達(dá)組織； D） 采用酵母雙雜交、 抗體制備、免疫 共 沉淀 、染色質(zhì)免疫共沉淀 等方法深入研究該基因調(diào)控胰腺發(fā)育的分子機(jī) 理 。 E）突變體的表現(xiàn)型分析。 2) ENU 化學(xué)誘變篩選具有肝臟或胰腺發(fā)育缺陷、肝臟或 β 細(xì)胞再生缺陷的突變體及其表現(xiàn)型研究 。 1） 斑馬魚肝臟和胰島 β細(xì)胞再生模型的建立及再生的細(xì)胞過程研究 。 將條件基因打靶的小鼠與特異表達(dá)重排酶的小鼠交配，形成特異組織器官的基因敲出小鼠，分析小鼠特異組織的形成改變和表型，確定基因活動(dòng)的上下游的分子基礎(chǔ)，初步研究內(nèi)胚層特異基因活動(dòng)的分子基礎(chǔ)。利用 LacZ 和 GFP 標(biāo)記內(nèi)胚層早期的細(xì)胞，在胚胎發(fā)育中跟蹤細(xì)胞的分化過程。 3） 構(gòu)建條件基因打靶小鼠。 克隆特異的內(nèi)胚層形成的靶基因片段，將 LacZ 和 GFPcDNA