【正文】 異表達基因的芯片篩選 。 2） 差異表達基因的功能及作用機理 研究。 3. 肝細胞命運決定后調(diào)控 肝臟發(fā)育基因 的 篩選與功能研究。 機械分離 前腸內(nèi)胚層區(qū)域 組織后， 利用 FACS 技術(shù)分離 gutGFP 斑馬魚 的 14hpf、 24 hpf、 48 hpf、 72 hpf和 96 hpf 胚胎中攜帶 GFP 的細胞，提取總 RNA 后制備探針 進行基因芯片分析，獲得并確 證 差異表達基因。 對于 通過基因芯片 獲得 的 新基因 ，我們 將 利用基因 過表達 和敲降 、 內(nèi)胚層特異性敲降、 整體原位雜交、 免疫組化 、酵母雙雜交、免疫共沉淀、染色質(zhì)免疫共沉淀等方法 研究 新基因的 功能 及其作用機理 。 1） 胚胎干細胞向肝臟前體細胞分化過程中命運決定的分子機理 。 Afp 的表達標志著內(nèi)胚層細胞進一步分化為肝臟前體細胞，因此我們將采用同源重組的方式，建立 afp 啟動子驅(qū)動報告基因表達的胚胎干細胞系。 我們已經(jīng)基本建立了胚胎干細胞向肝臟細胞定向分化的體系，整個分化過程與肝臟體內(nèi)發(fā)育過程相對應(yīng)，可分為三個階段：第一、 胚胎干細胞向內(nèi)胚層細胞分化階段 ，第二、 內(nèi)胚層細胞向肝臟前體細胞分化階段 ，第三、 肝臟前體細胞向成熟肝實質(zhì)細胞分化階段。進一步，我們將對 FGF 和 BMP 信號通路及其下游重要 10 信號通路 在胚胎干細胞向肝臟細胞分化過程中的功能進行深入分析。這些分析有助于進一步闡明 FGF和 BMP 信號通路在促進胚胎干細 胞向肝臟前體細胞命運決定的分子機 理 。 A） 尋找表面標記，用于分離 純化肝臟前體細胞 。 我們將通過基因芯片的方法，對分選得到的肝臟前體細胞進行基因表達分析，并與之內(nèi)胚層細胞階段和肝實 質(zhì)細胞階段進行比較，從而尋找調(diào)控肝臟前體細胞形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子 ； C） 研究關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子在胚胎干細胞向肝臟細胞分化過程中的功能 。 3） 胚胎干細胞來源的肝臟前體細胞的體外分化能力及分子機理研究。 5. 組蛋白 H3的 N端 三甲基化表觀遺傳調(diào)控機制 在由胚胎干細胞到 肝細胞分化過程 中的功能。 在肝細胞分化的不同階段 檢 測 細胞內(nèi)組蛋白 H3 N端 三甲基化與染色質(zhì)形成的 11 關(guān)系，確定染色質(zhì) —— 組蛋白 H3 N 端 三甲基譜。 利用 RTPCR 分析不同分化階段肝細胞內(nèi) 各種 組蛋白 H3 N 端 三甲基化酶表達， 克隆 相應(yīng)階段肝細胞內(nèi)特異的組蛋白 H3 N 端 三甲基化酶。 A）利用 N 端三甲基化的 組蛋白 H3 抗體和小鼠全基因組基因芯片，在肝細胞分化的不同時期將染色質(zhì)免疫共沉淀與基因芯片聯(lián)用（ ChIP on Chip），系統(tǒng)化地研究 N 端三甲基化的 組蛋白 H3 的染色質(zhì)附著位點在肝細胞分化不同階段的變化； B）選取具有代表性的附著位點，研究肝細胞分化不同階段在附著位點附近基因的轉(zhuǎn)錄水平變化，對于轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化的基因深入研究其在肝細胞分化過程中的功能及作用機制。 A） 在斑馬魚胚胎和 胚胎干細胞體系 中，抑制或過表達肝細胞特異的組蛋白 H3 N 端 三甲基化酶， 通過檢測肝臟不同發(fā)育時期的分子標記研究其在肝細胞分化 及肝臟發(fā)育 中的 功能； B）利用 ChIP on Chip，研究肝細胞特異性組蛋白 H3 N 端三甲基化酶功能缺失后，三甲基化 組蛋白 H3 在染色質(zhì)上附著位點的變化，以及對代表性位點附近基因轉(zhuǎn)錄的影響，對于轉(zhuǎn)錄受影響的基因深入研究其介導表觀遺傳調(diào)控肝細胞分化的分子機理。 1） 在 斑馬魚 內(nèi)胚層器官發(fā)育的不同階段 對 H3K4Me H3K27Me H3K9/18Ac、H4K12Ac 的表觀遺傳穩(wěn)定性及功能 的系統(tǒng) 化 研究 。 2） 選取 具有代表性的 表觀遺傳 位點，研究染色質(zhì) 上相應(yīng)位點 附近基因 在調(diào)控 內(nèi)胚層器官 發(fā)育 中的 功能 及分子機理 。 7. 具有 肝臟 發(fā)育 缺陷的斑馬魚突變體及致變基因的功能機制 研究。通過檢測內(nèi)胚層及肝臟發(fā)育不同時期的分子標記，研究突變體所具有的肝臟發(fā)育缺陷表現(xiàn)型。 A）同 全基因組 多型性標記（ polymorphic marker） 掃描 、 細菌人工染色體（ bacterial artificial chromosome， BAC）克隆 重疊群（ contig） 的建立、零重組多型性標記的獲得、候選致變基因的測序 等過程定位和克隆致變 基因 ； B）利用 特異性的 morpholino 和 mRNA 回救以 確 證致變 基因 ，研究其表達模式；C） 運用細胞移植 技術(shù) 研究 致變 基因 調(diào)控肝臟 發(fā)育 功能的 細胞自主（ autonomous） 或 非自主（ nonautonomous） 性 ，如果是非自主的 ，確定調(diào)控肝臟 發(fā)育 的致變基因表達組織； D） 采用酵母雙雜交、 抗體制備、免疫 共沉淀 、染色質(zhì)免疫共沉淀 等方法深入研究該基因調(diào)控 肝臟 發(fā)育的分子機 理 。 1） NEMO/IKK?及其多泛素化在調(diào)控斑馬魚肝臟發(fā) 育中的功能。 2） NEMO/IKK?多泛素化酶的確定及其在肝臟發(fā)育中的功能。 9. Wnt 信號途徑及其 上游 調(diào)控因子 KLP 在斑馬魚肝臟 發(fā)育中的功能機制。 A）利用 hsp:dkk1GFP 轉(zhuǎn)基因系，在 胚胎發(fā)育的不同時期抑制 Wnt 通路， 分析肝 臟分子標記 表達 的 變化 ； B）利用 全胚胎 原位雜交 和 Realtime PCR 等 ，獲得斑馬魚 Wnt 信號 途徑 分子表達的完整信息，確定不同發(fā)育時期參與 Wnt 途徑 激活的 潛在 信號分子 ，深入研究這些信號分子在肝 臟發(fā)育 中的 功能 與機制。 KLP 是我們在最近工作中發(fā)現(xiàn)的 Wnt 信號途徑上游調(diào)控因子。 C）在胚胎干細胞體外分化體系中，研究 KLP 過表達或抑制對肝細胞分化的影響。 1） 斑馬魚 原腸中后期 內(nèi)胚層細胞 、 4－ 6 體節(jié)時期 預定的 內(nèi)、外分泌 前體細胞及 非預定 的胰腺 前體細胞的分選， 四 者 差異表達基因的芯片篩選。 2） 差異表達基因的表達模式、功能和作用機制研究。 2. 非洲爪蟾 預定的胰腺內(nèi)胚層細胞 特異性調(diào)控因子的篩選和功能 機制 研究。利用 DMNBcaged fluorescein dextran 的單細胞激光定點 激發(fā) 進行 內(nèi)胚層 細胞 的 譜系定位 。 A）在上述細胞譜系定位的基礎(chǔ)上，進行基因芯片差異表達篩 15 選； B）對于篩選得到的差異表達基因，研究其表達模式、過表達或敲降后所 導致的胰腺發(fā)育表現(xiàn)型以確定其對胰腺發(fā)育的重要性。 A）對于篩選重要調(diào)控基因，研究其敲降或過表達對早期內(nèi)胚層或胰腺發(fā)育不同時期分子標記表達的影響； B）對于重要的調(diào)控因子制備其抗體，并進一步采用酵母雙雜交、免疫共沉淀、對于 DNA 結(jié)合因子采用 ChIPCloning，研究其相互作用因子、在染色質(zhì)上的結(jié)合位點、下游基因等，深入研究其調(diào)控胰腺發(fā)育的分子機理。 1） 利用大規(guī)模整體原位雜交從非洲爪蟾胚胎及成體的胰腺 cDNA 文庫 中篩選胰腺特異性表達的新基因。 2） 新基因調(diào)控胰腺發(fā)育的功能及分子機理研究。 4. Hex 特異性地誘導腹 側(cè) 胰腺前體細胞增多的分子機 理 研究 。 A）檢測 Hex過表達或敲降后胰腺的早期發(fā)育分子標記 pdx p48/ptf1a、肝臟分子標記prox1 表達； B）利用 BrdU 和 H3P（磷酸化組蛋白 H3）抗體染色，檢測Hex 的過表達對細胞增殖的影響，如果 Hex 過表達會導致細胞增殖加快，我們將在使用細胞增殖抑制劑 的情況下檢測 Hex 的過表達對巨大腹側(cè)胰腺的 16 誘導能力； C）在斑馬魚中過表達 Hex 以重復非洲爪蟾中的誘導巨大腹側(cè)胰腺的結(jié)果，如果得到類似結(jié)果，我們將利用細胞共移植技術(shù)研究 Hex 過表達對原腸胚期細胞遷移的影響，如果 Hex 過表達會影響細胞遷移，我們將在抑制原腸胚期細胞遷移的情況下檢測 Hex 的過表達對巨大腹側(cè)胰腺的誘導能力。 2） Hex 的相互作用因子、在染色質(zhì)上附著位點、下游調(diào)控基因的篩選及其調(diào)控胰腺發(fā)育的分子機理研究。 5. 非洲 爪蟾胚胎胰腺 和肝臟 的 體外 重建。 在 已有認識及本項目其它工作 的基礎(chǔ)上 ，我們將系統(tǒng)地進行胰腺和肝臟的 體外重建 研究， Hex、 Ptf1a/p48 和 Pdx1 以及本項目研究中獲得新功能因子 將是這一重建過程研究中的首選 因子。 我們將綜合運用本課題中的所有研究成果 ，在研究胰腺早期發(fā)育機制的基礎(chǔ)上系統(tǒng)地尋找在爪蟾胚胎前體細胞中重建胰腺發(fā)育及成熟的胰島 β細胞的最佳方案 ，該方案將隊友的哺乳類胚胎干細胞形成成熟的胰島 β細胞具有直接的參考價值 。 1） 分別建立 PDX1 和 NGN3 啟動子驅(qū)動 GFP 和 RFP 表達的報告體系 。 2） 研究 RA, BMP, FGF 等信號途徑調(diào)控 pdx1 表達的分子機理 。在此基礎(chǔ)上，通過對不同分化階段中 PDX1 表達細胞的表達譜分析，尋找伴隨PDX1 變化的其他信號分子； B） 在內(nèi)胚層的基礎(chǔ)上，分別用 RA, BMP, FGF等信號分子單獨或互相組合來處理胚胎干細胞來源的內(nèi)胚層細胞，通過觀察PDX1 的表達變化，來研究這些信號分子對胰腺命運 決定 的功能作用。 A）在胰腺特化的分化階段，分離 PDX1+細胞，通過基因芯片技術(shù)分析胰腺前體細胞特征性的基因表達模式，從而為研究胰腺的 命運決定 提供線索； B）體外培養(yǎng)分選得到的 PDX1+胰腺前體細胞，進行進一步的誘導分化，以 Notch 信號通路為線索，檢測不同信號通路對分化得到的內(nèi)、外分泌部細胞比例的影響，從而分析在內(nèi)、外分泌部命運決定過程中起關(guān)鍵調(diào)控作用的信號通路，并進一步分析這些信號通路與 Notch 信號通路的關(guān)系； C）通過對不同分化階段 PDX1 表達細胞的表達譜分析，尋找伴隨NGN3 表達變化的信號分子，同時分析 Sox9, Foxa2, Hnf6, Tcf2 的表達情況，從而找到和 NGN3 表達變化直接相關(guān)的信號通路。在胰腺內(nèi)分泌前體細胞 命運決定 的相應(yīng)分化階段，分離 NGN3+細胞，通過基因芯片技術(shù)分析胰腺內(nèi)分泌前體細胞特征性的基因表達模式，從而為研究胰腺內(nèi)分泌的 命運決定 提供線索。 18 7. 具有胰腺 發(fā)育 缺陷的斑馬魚突變體及致變基因的功能機制 研究。通過檢測內(nèi)胚層及胰腺發(fā)育不同時期的分子標記，研究突變體所具有的胰腺發(fā)育缺陷表現(xiàn)型。 A）同 全基因組 多型性標記（ polymorphic marker） 掃描 、 細菌人工染色體（ bacterial artificial chromosome， BAC）克隆 重疊群（ contig） 的建立、零重組多型性標記的獲得 、候選致變基因的測序等過程定位和克隆致變 基因 ； B）利用 特異性的 morpholino 和 mRNA 回救以 確 證致變 基因 ，研究其表達模式；C） 運用細胞移植 技術(shù) 研究 致變 基因 調(diào)控 胰腺發(fā)育 功能的 細胞自主（ autonomous） 或 非自主（ nonautonomous） 性 ，如果是非自主的 ，確定調(diào)控 胰腺發(fā)育 的致變基因表達組織； D） 采用酵母雙雜交、 抗體制備、免疫 共沉淀 、染色質(zhì)免疫共沉淀 等方法深入研究該基因調(diào)控胰腺發(fā)育的分子機 理 。 1） 利用三維培養(yǎng)體系，從小鼠 胚胎和新生小鼠體內(nèi)分離和富 集 內(nèi)胚層組織的干細胞 /前體細胞，確定其表面標記。 2） 分析成體小鼠內(nèi)的干細胞 /前體細胞組分。 3） 分析 內(nèi)胚層組織 干細胞 /前體細胞的 特異 基因表達模式，確定干細胞 /前 體 細胞內(nèi)特異基因表達 。 4） 建立體外干細胞 /前體細胞分化體系 ， 確定內(nèi)胚層 組織的 細胞分化譜 。 在體外建立內(nèi)胚層細胞分化培養(yǎng)體系，應(yīng)用生長因子和小分子誘導干細胞 /祖細胞定向分化形成消化道、肝或肺等內(nèi)胚層細胞。 5） 建立體內(nèi)細胞分化測定體系，確定體內(nèi)分化 細胞 譜，比較體內(nèi)外分化譜的異同，明確 內(nèi)胚層組織的 細胞分化測定手段 。 9. 在小鼠胚胎發(fā)育過程中，確定小鼠內(nèi)胚層組織的干細胞 /祖細胞的形成、分化的子代細胞譜與分化途徑，探索內(nèi)胚層組織的構(gòu)筑?？寺∫延械墓ぷ髦写_定的與消化道、肝及肺等內(nèi)胚層組織器官基因，制備探針，在成體小鼠體內(nèi)，確定探針的特 異性。 3） 篩選內(nèi)胚層分化過程中的 特異表達的基因 。 4） 分離 單 細胞到器官形成期的小鼠胚胎， 對 胚胎內(nèi)胚層 細胞進行譜系定位 ，為系統(tǒng)分析小鼠內(nèi)胚胎發(fā)育提供基礎(chǔ) 。 20 10. 建立內(nèi)胚層組織特異基因條件 敲除 小鼠， 標記內(nèi)胚層組織起源細胞， 分析內(nèi)胚層組織的形成與構(gòu)筑的過程，探討內(nèi)胚層組織形成的分子機制。 確定本項目組內(nèi)在早蟾和斑馬魚內(nèi)克隆的內(nèi)胚層發(fā)育的特異基因，與小鼠體內(nèi)確定的基因進行比較，明確在分化與發(fā)育過程中， 發(fā)揮 重要作用的基因譜。 2） 構(gòu)建條件性基因打靶的 ES 細胞 ， 體外分析細胞的分化能力 。并在體外建立分化體系，確定 ES 細胞的分化能力，和內(nèi)胚層形成的體外過程。 將同源重組的 ES 細胞注射到小鼠的囊胚中，構(gòu)建嵌合體小鼠，經(jīng)傳代形成基因打靶小鼠。 4） 分析內(nèi)胚層分化發(fā)育的分子基礎(chǔ)與分子機制。 課題三： 正向遺傳突變篩選具有 內(nèi)胚層器官發(fā)育或再生缺陷的突變體及致變基因的功能機制研究 1. 斑馬魚肝臟和胰島 β細胞再生模型的建立及 ENU 正向