【正文】 合基因芯片和生物信息學(xué)分析平臺(tái)，精確分離鑒定細(xì)胞特異和侵染早期的寄主響應(yīng)基因，尤其是對(duì)腐生菌 (小麥赤霉病 )的抗病相關(guān)基因，建立防衛(wèi)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)。 6. 將分子遺傳、轉(zhuǎn)基因技術(shù)和作物育種學(xué)結(jié)合，進(jìn)行抗病分子設(shè)計(jì)育種，選育廣譜抗病水稻和小麥品系，建立分子 設(shè)計(jì)育種的理論與技術(shù)體系。 目前我國(guó)在這方面的研究與技術(shù)體系與歐美等國(guó)家相比，還具有很大的的差距 。本項(xiàng)目根據(jù) 學(xué)科發(fā)展和本國(guó)農(nóng)作物病害的特點(diǎn)，立足于創(chuàng)新、突出研究重點(diǎn)、發(fā)揮自身優(yōu)勢(shì)，做出跨越式的發(fā)展并提升我國(guó)在本領(lǐng)域的研究水平和地位。 圍繞國(guó)際學(xué)科發(fā)展趨勢(shì)，以系統(tǒng)闡明植物包括重要糧食作物的免疫機(jī)理為目標(biāo)，結(jié)合我國(guó)轉(zhuǎn)基因新品種培育中抗病分子育種這一重大需求。 2. 從農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和學(xué)科發(fā)展中 提煉關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題，創(chuàng)建 特色研究體系 。為此，在相關(guān)領(lǐng)域設(shè)置了 6 個(gè)相互交叉的研究課題，并 把主要研究方向集中在水稻和麥類(lèi)抗病分子機(jī)理，推動(dòng)以水稻抗病性為主要模式體系的轉(zhuǎn)換，建立我國(guó)特色的植物免疫和作物抗病育種基礎(chǔ)理論的前沿領(lǐng)域。國(guó)際上 植物免疫的研究已經(jīng)進(jìn)入更高層次的研究領(lǐng)域。尤其是 植物免疫的表觀遺傳機(jī)制是植物生物學(xué)的新興研究領(lǐng)域，存在若干重要的科學(xué)問(wèn)題亟待闡明。抗病 RNA 沉默 的 研究也主要 集中 在擬南芥和煙草上 。以植物免疫的表觀遺傳機(jī)制為主線，從模式植物到我國(guó)主要糧食作物，結(jié)合項(xiàng)目各課題組已建立起來(lái)、各具特色的實(shí)驗(yàn)體系和工作平臺(tái)， 拓展表觀遺傳機(jī)制調(diào)控抗?。ú《?、細(xì)菌和真菌）應(yīng)答研究領(lǐng)域。 4. 利用和創(chuàng)制特色研究材料。并以已經(jīng)定位克隆的、有自主知識(shí)產(chǎn) 權(quán)的一批重要廣譜抗病基因如 xa1 Xa30， Pigm、 Pid ROD OsNPR 等為研究的重要出發(fā)點(diǎn)， 緊密結(jié)合作物遺傳育種 ，建立作物抗病分子設(shè)計(jì)的理論、應(yīng)用基礎(chǔ)和共性技術(shù)體系。本項(xiàng)目 廣泛采用 ‘組學(xué) ’和 ‘復(fù)雜性狀 ’的研究方法，利用正向、反向遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)，并結(jié)合生物信息學(xué)、蛋白組學(xué)、現(xiàn)代生物化學(xué)等研究技術(shù)，系統(tǒng)剖析 作物對(duì)重要病原菌的識(shí)別機(jī)制與應(yīng)答的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，并整合作物抗病性與產(chǎn)量性狀的互作途徑， 創(chuàng)建抗病分子設(shè)計(jì)育種體系。 6. 新的目標(biāo)視野。 創(chuàng)新性研究成果（如水稻廣譜抗病性基因）的應(yīng)用有可能為農(nóng)作物抵抗類(lèi)似于水稻紋枯病這樣的疑難病害做出重大貢獻(xiàn)。 7. 新的研究隊(duì)伍建設(shè)。 （四）取得重大突破的可行性分析 在植物免疫和作物抗病性研究領(lǐng)域，雖然要全面超越國(guó)際一流研究水平還要進(jìn)行長(zhǎng)期、艱苦的研究與探索，但是本項(xiàng)目的實(shí)施也存在諸多有利因素，其中包括研究資源、研究基礎(chǔ)、人才隊(duì)伍和儀器裝備等幾方面的有利條件，本項(xiàng)目具備圓滿完成預(yù)定計(jì)劃的能力和工作條件。 2. 具有豐富的研究資源 。這為本項(xiàng)目通過(guò)功能基因?qū)W的方法，研究不同農(nóng)作物品種抗病分子機(jī)理，在以水稻為主的重要農(nóng)作物的抗病分子機(jī)理研究，可以做出創(chuàng)新 性和有特色的研究成果。 近年來(lái)植物分子生物學(xué)研究飛速發(fā)展，擬南芥及水稻基因組已相繼完成測(cè)序， 小麥基因組 454 高通量序列的豐富， 基因定位克隆已經(jīng)實(shí)現(xiàn)日?；?。這些成熟的技術(shù)平臺(tái)為順利開(kāi)展本項(xiàng)目并完成目標(biāo)提供了可靠的保障。通過(guò)承擔(dān)國(guó)家 863 計(jì)劃、國(guó)家基金重大研究計(jì)劃和重點(diǎn)項(xiàng)目、國(guó)家轉(zhuǎn)基因新品種培育重大項(xiàng)目等多項(xiàng)研究的積累，本 項(xiàng)目組各個(gè)課題已經(jīng)在科學(xué)研究思路、實(shí)驗(yàn)材料、研究實(shí)驗(yàn)體系、數(shù)據(jù)分析能力、國(guó)際學(xué)術(shù)交流等方面打下了較好的研究基礎(chǔ)。項(xiàng)目的實(shí)施將依托 7 個(gè)國(guó)家和 3個(gè)部門(mén)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（詳見(jiàn)工作條件部分），具有先進(jìn)的儀器設(shè)備和國(guó)內(nèi)一流的工作條件。 5. 研究隊(duì)伍具備國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力 。在過(guò)去數(shù)年間，本項(xiàng)目骨干作為第一或通訊作者的多篇研究論文發(fā)表于國(guó)際重要學(xué)術(shù)期刊如 Cell 及其系列 , Nature 系列 , Science, Plant Cell, PNAS, Genome Research, EMBO J, Cell Host amp。具備進(jìn)行創(chuàng)新研究的團(tuán)隊(duì)基礎(chǔ)和較強(qiáng)的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)實(shí)力。這些條件均對(duì)本項(xiàng)目的開(kāi)展是一個(gè)有力 的支持。 2. Xoo 鞭毛蛋白基因 /解毒蛋白基因及突變體的克隆 ； 構(gòu)建 Xoo/Xoc 鞭毛蛋白等 PAMPs 編碼基因的缺失突變體；構(gòu)建多個(gè)水稻基因變量表達(dá)的雙元載體 ； 效應(yīng)蛋白基因轉(zhuǎn)基因 ； 建立純化EPS 天然寡聚體的技術(shù)平臺(tái)以及 EPS寡聚體生物活性檢測(cè)系統(tǒng)。 4. 利用γ ray輻射誘變和 EMS化學(xué)誘變抗病品種 GM4(Pigm)，篩選 Pigm 基因的抑制因子 spi（ suppressors of Pigm） ；利用體內(nèi)和體外方法篩選水稻 EMS誘變 F2 群體，獲得對(duì) Xoo LPS 敏感性發(fā)生改變的突變材料，創(chuàng)建該突變材料的分離群體并開(kāi)始進(jìn)行圖位克隆 ； 。 5. 采用激光顯微切割，結(jié)合禾 谷鐮孢活體熒光標(biāo)記、基因組芯片等，揭示宿主作物細(xì)胞在禾谷鐮孢侵染中、晚期的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄組；研究宿主作物 禾谷鐮孢互作細(xì)胞學(xué)過(guò)程 ； 病毒侵染擬南芥，microarray 高通量表觀遺傳途徑相關(guān)蛋白基因表達(dá)檢測(cè)；抗病 TGS 蛋白目標(biāo)基因篩選、及其表達(dá)譜檢測(cè)。 2. 明確兩種 Xoo/Xoc PAMPs 突變體對(duì)水稻致病性的變化；明確 Xoo/Xoc 鞭毛蛋白和另外一種 PAMPs誘導(dǎo)水稻的防御反 應(yīng)的能力；構(gòu)建 35 個(gè)水稻轉(zhuǎn)基因載體 。 4. 得到宿主作物細(xì)胞在禾谷鐮孢侵染中、晚期的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄組 ； 利用基因組方法分析 RDV病毒感染后水稻基因組的變化。 6. 篩選并獲得水稻 LPS 非敏感型突變體；建立篩 選 LPS 結(jié)合蛋白的生化體系并開(kāi)展篩選工作 。 8. 構(gòu)建水稻 OsNPR1 基因的遺傳學(xué)研究株系并進(jìn)行表型鑒定；獲得水稻抗ROD 基因轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證材料；定位克隆 2 個(gè)以上水稻抗白葉枯病基因或QTL； 發(fā)表關(guān)于 Pigm 基因功能的相關(guān)論文。 10. 獲得小麥 EDR1 和 EDR2 基因 各 1個(gè) ； 克隆水稻 PID3 和小麥 Yr 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) RDR1,RDR6,AGOs,PolIV,PolV,DCL2 等 ；利用酵母雙雜交方法，篩選受 RDV 病毒侵染前后水稻基因表達(dá)譜的變化并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè) 。 RNAseq測(cè)序 ， 建立 mRNA 表達(dá)譜 。 9. 完成對(duì) Pigm 基因的功能鑒定工作；水稻抗 ROD 基因的克??；水稻抗白葉枯病基因或 QTL 的定位；小麥抗銹病 QTL 的定位工作；抗黃萎病相關(guān)基因的定位工作 ； 新型等位基因的克?。嚎寺∷?稻 PID3 基因以及小麥 YrYr18 和 Yr36 的新型等位基因 ； 小麥EDR1 和 EDR2 基因的獲得 ； 10. 構(gòu)建 xa5Xa21Pid2Pid3 聚合載體和Yr10Yr18Yr36 聚合載體（自然表達(dá)，即使用自身啟動(dòng)子） ；開(kāi)展 廣譜抗病品種的轉(zhuǎn)基因及分子育種工作，水稻抗病基因的分子標(biāo)記聚合育種：利用基因標(biāo)記，將水稻 xa Xa2 Pid2 和Pid3 基因轉(zhuǎn)育我國(guó)超級(jí)雜交稻的恢復(fù)系親本 9311 和明恢系列的品種；水稻 Pigm 與 Pi9 基因重組位點(diǎn)的創(chuàng)建； 小麥抗條銹病基因的分子標(biāo)記聚合育種： 利用基因標(biāo)記，將小麥Yr Yr18 和 Yr36 基因轉(zhuǎn)育我國(guó)小麥主產(chǎn)區(qū)品種“ 濟(jì)麥 19”和“ 鄭麥9023”。 11. 獲得一批廣譜抗病轉(zhuǎn)基因或分子育種品系； 獲得 1000 份攜帶水稻 PID3 或小麥 Yr Yr1 Yr36 等 基因 的材料。 13. 獲得有 10 萬(wàn)個(gè)體的 F2 群體，篩選獲得鑒定 Pigm 和 Pi9 基因的菌株 23個(gè)，特異鑒別這兩個(gè)基因的 PCR 分子標(biāo)記 23 個(gè)。 15. 申請(qǐng)專(zhuān)利 56 個(gè)。 2. Xoo 鞭毛蛋白 /解毒蛋白的分離純化及生化分析；效應(yīng)蛋白對(duì)宿主信號(hào)通路的作用分析 ； 抗病蛋白不同結(jié) 構(gòu)域間互作分析，及這種互作與蛋白功能和下游信號(hào)通路之間的關(guān)系分型；構(gòu)建大麥表皮細(xì)胞富集百分病菌轉(zhuǎn)錄本的酵母雙雜交 cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建。 4. 鑒定 BBI1 （ E3 ligase ），OsRAR1,OsNPR1,OsSGT1 的感病純合突變單株 ,分別與含有 Pigm 轉(zhuǎn)基因日本晴株系雜交 。 6. 進(jìn)行抗病 TGS目標(biāo)蛋白作用關(guān)鍵靶基因篩選、及其 DNA 的作用模式分析、同時(shí)進(jìn)行病毒侵染關(guān)鍵靶基因表達(dá)譜改變分析； 探索病毒侵染對(duì)水稻包括miRNA 在內(nèi)的內(nèi)源 RNAs表達(dá)的影響。 8. 鑒定及獲得帶有乙烯耐受基因的抗性水稻株系；分析在阻斷乙烯反應(yīng)后對(duì)稻瘟病菌的抗病 變化 。 利用microarray 等技術(shù)，分析 OsNPR1 基因介導(dǎo)的 SAR 與生長(zhǎng)素信號(hào)途徑等之間1. 再分離鑒定 PTI途徑基因 12個(gè) 及 ETI途徑基因 12 個(gè)，并明確這些基因的功能。 2. 明確水稻 OsFLS2 對(duì)鞭毛蛋白的感知能力；獲得涉及 2 個(gè)基因的變量表達(dá)的突變體株系；構(gòu)建獲得 2 個(gè)水稻病原菌誘導(dǎo)表達(dá)的 cDNA 文庫(kù)。 4. 得到宿主作物細(xì)胞在禾谷鐮孢侵染早期的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄組；揭示其與作物細(xì)胞本身能量、物質(zhì)代謝途徑交叉互作的結(jié)點(diǎn) /關(guān)鍵分子。 6. 對(duì) LPS 受體基因進(jìn)行遺傳和物理定位；構(gòu)建候選 LPS 結(jié)合蛋白的水稻遺傳學(xué)研究株系。 8. 鑒定與 RDV P2 蛋白互作的水稻蛋白并分析其可能的 生化功能。 10. 完成 ROD 基因功能鑒定工作； 完成水稻抗白葉枯病基因（ QTL）的功能鑒定；獲得 Pigm/ROD 的 supprosser 的穩(wěn)定突變；定位克隆一個(gè)抗銹病 QTL； 11. 分別獲得 410 個(gè) xa5Xa21Pid2Pid3 或 Yr10Yr18Yr36 陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因株系 410 個(gè) 。 9. ROD 基因功能的鑒定工作；水稻抗白葉枯病基因（ QTL）的功能鑒定工作；新廣譜抗病基因（ QTL）的定位工作；抗銹病 QTL 的定位工作 ； 研究抗黃萎病相關(guān)基因。 10. 分別將 xa5Xa21Pid2Pid3 聚合載體和 Yr10Yr18Yr36 聚合載體導(dǎo)入水稻品種明恢系列或小麥品種濟(jì)麥等系列。 的新型設(shè)計(jì)抗病基因 25 個(gè)。 14. 發(fā)表 SCI 文章 1012 篇。 第 三 年 1. PTI 通路新基因的生化和分子生物學(xué)分析 ； PRR 受體蛋白互作蛋白的功能鑒定。 3. 對(duì) bir1, snc1, snc2, snc4, mkk1 mkk2這5 個(gè)突變體做進(jìn)一步的抑制子篩選，克隆更多的基因 ； 利用圖位克隆和全基因組測(cè)序技術(shù)篩選到 SAR 突變體的突變位點(diǎn) ； MEKK1 結(jié)合蛋白及 FLS2介導(dǎo)的磷酸化蛋白的 功能驗(yàn)證 。 4. 利用圖位克隆的方法鑒定 spi 基因。 5. 綜合運(yùn)用 各種生物手 段具體研究禾谷1. 認(rèn)識(shí) PTI 途徑相關(guān)基因編碼蛋白的生化和分子生物學(xué)特性 ； 明確 ETI 途徑相關(guān)基因編碼的抗病蛋白的生理生化特性 ； 明確病原菌效應(yīng)蛋白靶標(biāo)基因的功能及分子特性。 3. 明確 12 個(gè) RLKs、 WRKYs 或 ERFs 在水稻抗病性中的作用；篩選獲得一批與 RLK、 WRKY或 ERF互作的候選蛋白；初步確定 PTI 中受調(diào)控的基因。 5. 克隆到 1 個(gè) Pigm 的抑制子 spi。 6. 構(gòu)建關(guān)鍵靶基因過(guò)表達(dá)和敲除突變體，并進(jìn)行病毒侵染性的分析 ； 研究水稻 RNA 干擾途徑對(duì)病毒侵染的抵抗作用 ； 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證小 RNA 與潛在靶標(biāo)的調(diào)控關(guān)系；在水稻 dcl4 突變體中受Xoo誘導(dǎo)的水稻小 RNA 的表達(dá)是否依賴(lài) dcl4 基 因。 8. 繼續(xù) ROD 基因研究工作 ； 水稻抗白葉枯病基因（ QTL）的功能鑒定 ， 克隆 2個(gè)新的廣譜抗病基因（ QTL ） ；Pigm/ROD 的 supprosser 突變基因的定位工作 ； 新的抗銹病 QTL 的定位；繼續(xù)克隆抗黃萎病相關(guān)基因。 9. 評(píng)價(jià) xa5Xa21Pid2Pid3 聚合載體對(duì)水稻白葉枯病和稻瘟病的 抗性特征；評(píng)價(jià) Yr10Yr18Yr36 聚合載體對(duì)小麥條銹病的 抗性特征。 10. 利用基因標(biāo)記，繼續(xù)水稻 xa Xa2Pid2 和 Pid3 基因的回交轉(zhuǎn)育 。 和調(diào)控作用。 8. 分析候選水稻 LPS 受體及結(jié)合蛋白的功能及在病原識(shí)別和發(fā)育調(diào)控中的分子功能。 10. 研究 P2 蛋白影響 GA合成途徑的關(guān)鍵因子及影響機(jī)制 。 12. 確定 EDR1 和 EDR2 轉(zhuǎn)基因在受體基因組的整合和表達(dá)模式；獲得具有新型抗性特征的基因 12 個(gè) ； 確定多基因聚合載體在受體基因組的整合和表達(dá)模式； 確定多基因聚合載體賦予受體植株的抗病特征。 14. 發(fā) 表 SCI 收錄論文 1824 篇 。 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 四 年 1. PTI 通路新基因在植物抗病途徑信號(hào)傳導(dǎo)途徑中作用及位置分析； PRR 受體蛋白互作蛋白下游信號(hào)通路研究。 3. 熒光互補(bǔ)與免疫共沉淀研究 PTI 基因網(wǎng)絡(luò)中至少 2 個(gè)蛋白間的相互作用；構(gòu)建從酵母雙雜交或免疫沉淀篩選到PTI 基因網(wǎng)絡(luò)中的重要組分的過(guò)量表達(dá)與 RNAi 轉(zhuǎn)基因