【正文】 錄后 水平的各層次深入揭示豬、雞肌肉和脂肪組織發(fā)生、細(xì)胞分化和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中， DNA 與蛋白質(zhì)修飾、 miRNA 調(diào)控、外周信號(hào)等作用的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)生機(jī)制，從而闡明肌肉和脂肪生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制 。力爭(zhēng)在肌肉和脂肪發(fā)育生物學(xué)理論的基礎(chǔ)研究與應(yīng)用方面取得重大突破，為我國(guó)發(fā)育生生物學(xué)的發(fā)展搭建新的理論研究平臺(tái)，組建創(chuàng)新型研究團(tuán)隊(duì)，整體提升我國(guó)本學(xué)科領(lǐng)域在國(guó)際學(xué)術(shù)界的地位，推動(dòng)我國(guó)自主創(chuàng)新型醫(yī)學(xué)和畜牧科技的快速發(fā)展。這一目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)將為本相目與國(guó)內(nèi)將后的相關(guān)研究提供研究資源與技術(shù)方法。這一目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)，將取得在豬、雞 肌肉和脂肪干細(xì)胞分化機(jī)制認(rèn)識(shí)方面的突破，提升我國(guó)在豬、雞肌肉和脂肪干細(xì)胞方面的研究水平。 miRNA 文庫(kù)將達(dá)到國(guó)內(nèi)領(lǐng) 6 先和國(guó)際先進(jìn)水平，同時(shí)使我國(guó)在 miRNA 對(duì)豬、雞骨骼肌和脂肪發(fā)育控制作用及其調(diào)控機(jī)制方面的研究進(jìn)入國(guó)際先進(jìn)行列。這一目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)，將進(jìn)一步提高我們對(duì)豬、雞肌肉和脂肪發(fā)育分子調(diào)控機(jī)制的深入認(rèn)識(shí)，積累組織器官發(fā)育的新知識(shí)，為發(fā)育原理在畜牧生產(chǎn)與醫(yī)學(xué)實(shí)踐中的應(yīng)用提供指導(dǎo)作用。這是發(fā)育領(lǐng)域的開(kāi)拓性研究，這將豐富我們對(duì)發(fā)育分子機(jī)理的認(rèn)識(shí)，將為我國(guó)豬、雞品種 資源的有效利用提供科學(xué)依據(jù)，增強(qiáng)我國(guó)畜牧生產(chǎn)的自主創(chuàng)新能力。這一目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)將是發(fā)育原理用于生產(chǎn)實(shí)踐的重大突破，雖然本目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)存在一定風(fēng)險(xiǎn)，但至少將在轉(zhuǎn)基因技術(shù)方面取得一定突破，為旨在提高生產(chǎn)性能、抗病性能和作為生物孵化器的轉(zhuǎn)基因雞培育提供可借鑒的理論技術(shù)資料。申請(qǐng)發(fā)明專利 35 項(xiàng)。 7 三、研究方案 （一）實(shí)現(xiàn)預(yù)期目標(biāo)的 總體 研究思路項(xiàng)目研究的技術(shù)路線及可行性分析 總體思路 豬和雞作為重要的模式生物和經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，近些年來(lái)對(duì)其遺傳與發(fā)育學(xué)研究已取得了一些重大突破。 實(shí)際上 ， 肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)與發(fā)育調(diào)控是一系列相關(guān)基因的時(shí)序性表達(dá)和關(guān)閉的結(jié)果，對(duì)這些基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的全面解析是后基因組時(shí)代的主要研究?jī)?nèi)容。 本項(xiàng)目針對(duì)上述問(wèn)題展開(kāi)研究，結(jié)合我們前期的工作基礎(chǔ)，運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)的先進(jìn)方法，從胚胎期組織發(fā)生、細(xì)胞分化、出生后生長(zhǎng)和發(fā)育等多階段，在DNA、 RNA、蛋白質(zhì)等多層次上展開(kāi)研究，期望在豬、雞骨骼肌和脂肪發(fā)育調(diào)控的遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)與外周信號(hào)調(diào)控機(jī)制多方面取得重大突破，為推進(jìn)我國(guó)發(fā)育生物學(xué)、比較醫(yī)學(xué)和畜禽的遺傳育種研究與實(shí)踐奠定堅(jiān)實(shí)理論與技術(shù) 基礎(chǔ)。同時(shí)，進(jìn)行 miRNA 雞培育新技術(shù)方法研究，力爭(zhēng)培育成功優(yōu)化肌肉和脂肪生長(zhǎng)的 miRNA雞。 分子水平研究的技術(shù)包括：高效毛細(xì)管電泳，免疫熒光技術(shù)，共聚焦顯微鏡技術(shù)， Western blot 技術(shù)，原位雜交，免疫組織熒光，染色質(zhì)免疫共沉淀，基因克隆，報(bào)告基因技術(shù)、基因缺失和點(diǎn)突變， 甲基化間區(qū)位點(diǎn)擴(kuò)增， Gelshift 技術(shù)， 基因表達(dá)譜芯片技術(shù)，代謝譜分析技術(shù)，蛋白質(zhì)雙向電泳，蛋白質(zhì)飛行時(shí)間質(zhì)譜，時(shí)間分辨熒光分析，蛋白質(zhì)相互作用分析技術(shù)等。 動(dòng)物模型整體水平研究的技術(shù)包括：豬和雞的基因敲入 技術(shù) 、敲除技術(shù)，活體雞胚基因干擾 技術(shù)、 基因過(guò)表達(dá) 技術(shù)， 豬和雞成體組織 技術(shù)等。 近年來(lái)，對(duì)鼠和人的肌肉與脂肪發(fā)育及其調(diào)控機(jī)理的認(rèn)識(shí)愈來(lái)愈深入， 肌細(xì)胞與 脂肪細(xì)胞的分化都是由一系列轉(zhuǎn)錄因子（ Pax3myoDmyoG、 C/EBPPPAR SREBP）順序調(diào)控的結(jié)果，其基本調(diào)控線路已初步得到解析。這些工作為本項(xiàng)目研究取得重大突破提供了理論基礎(chǔ)。 隨著后基因組學(xué)時(shí)代的到來(lái)，有關(guān)表觀遺傳學(xué)、蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)的研究逐漸深入，新的生物學(xué)研究技術(shù)手段也日新月異。 （ 3） 申請(qǐng)單位有良好的前期研究基礎(chǔ)。 同時(shí)，闡明了脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴包被蛋白 Perilipin 和 ADRP 的泛素化修飾調(diào)節(jié)機(jī)制，研究了Perilipin 下調(diào)及其磷酸化調(diào)節(jié)脂肪分解的分子機(jī)制，對(duì) PPARγ 激動(dòng)劑及甾體類激素調(diào)節(jié)脂肪生成和脂肪分解的分子機(jī)制的研究也在進(jìn)行。 對(duì) 中外豬種肌肉發(fā)育差異的分子機(jī)制研究以及豬和雞基因組非編碼 RNA 的研究也取得了進(jìn)展。 （ 4）本項(xiàng)目的研究團(tuán)隊(duì)具備很強(qiáng)的研究實(shí)力與 良好的研究平臺(tái) 。整個(gè)項(xiàng)目的主要參與人員都為創(chuàng)造力旺盛的中青年科學(xué)家，具有多年在歐美等國(guó)一流實(shí)驗(yàn)室工作的經(jīng)驗(yàn)和廣泛的文獻(xiàn)接觸面，對(duì)本研究領(lǐng)域的重大問(wèn)題及技術(shù)手段都具有獨(dú)到的見(jiàn)解。 開(kāi)展本項(xiàng)目研究已有較好的技術(shù)平臺(tái)支撐，承擔(dān)單位擁有 2 個(gè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 5 個(gè)部級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，項(xiàng)目所需的絕大部分實(shí)驗(yàn)儀器和實(shí)驗(yàn)手段均已具備，各承擔(dān)單位間有著長(zhǎng)期 的良好合作關(guān)系和基礎(chǔ)。 （二）項(xiàng)目的創(chuàng)新點(diǎn) 盡管已經(jīng) 發(fā)現(xiàn)大量與豬、雞肌肉和脂肪發(fā)育調(diào)控相關(guān)的基因。本項(xiàng)目在前期基礎(chǔ)上，對(duì)在肌肉和脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中，外周信號(hào)分子調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、表觀遺傳和功能基因表達(dá)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)展開(kāi)系統(tǒng)深入的研究，在研究?jī)?nèi)容及關(guān)鍵問(wèn)題的選擇上有明顯創(chuàng)新。根據(jù)已有的報(bào)道及本項(xiàng)目組的前期研究結(jié)果，提示豬、雞肌肉與脂肪細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及其調(diào)控機(jī)制與鼠等模式試驗(yàn)動(dòng)物有所不同，豬和雞的肌肉與脂肪發(fā)育調(diào)控在一些方面可能比鼠更近似于人類。本項(xiàng)目選擇豬和雞作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，不僅可以彌補(bǔ)其它模式動(dòng)物研究的許多不足，而且可以從比較生物學(xué)的角度深入探討肌肉和脂肪發(fā)育調(diào)控分子機(jī)制與進(jìn)化。因此 ，本研究在研究對(duì)象的選擇上具有一定的創(chuàng)新。本項(xiàng)目在傳統(tǒng)發(fā)育生物學(xué)研究的基礎(chǔ)上，運(yùn)用蛋白質(zhì)飛行時(shí)間質(zhì)譜，染色質(zhì)免疫共沉淀芯片，核酸和蛋白質(zhì)芯片，時(shí)間分 11 辨熒光分析， RNAi 技術(shù)， miRNA 研究技術(shù)，以及病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型等先進(jìn)方法手段，解決發(fā)育生物學(xué)的基本問(wèn)題，與以往單個(gè)基因的局部功能研究相比，在研究方法和研究思路上具有明顯創(chuàng)新。 生命科學(xué)的研究進(jìn)展表明，基因表達(dá)的調(diào)控在多個(gè)層面上受到多種因素的作用，從單一層面或研究單一因子的作用只能獲得有限和片面的信息，在各個(gè)水平上展開(kāi)高通量平行研究是取得突破的關(guān)鍵 。 2. 課題之間的相互關(guān)聯(lián) 本項(xiàng)目 設(shè)置的 4 個(gè)課題從不同研究層次闡明骨骼肌和脂肪干細(xì)胞分化、組織生長(zhǎng)發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制，雖然各有側(cè)重但彼此緊密關(guān)聯(lián)。 課題研究?jī)?nèi)容 和目標(biāo) 12 課題 骨骼肌和脂肪干細(xì)胞的自我更新和分化的分子機(jī)制 主要研究?jī)?nèi)容 研究骨骼肌和脂肪干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化和分子事件 研究豬、雞胚胎期肌肉和脂肪胚胎干細(xì)胞和不同來(lái)源成體干細(xì)胞的分離與鑒定方法；研究完善豬、雞肌肉和脂肪胚胎與成體干細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法；和定向分化誘導(dǎo)方法。 關(guān)鍵功能基因在骨骼肌和脂肪干細(xì)胞的分化過(guò)程中的作用及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 采用 RNAi 和過(guò)表達(dá)技術(shù)確定候選基因在骨骼肌 和脂肪干細(xì)胞分化過(guò)程中的功能；采用報(bào)告基因和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控策略研究這些關(guān)鍵功能基因的作用及其作用的信號(hào)通路。 外周信號(hào)分子的作用及其調(diào)控關(guān)鍵功能基因的細(xì)胞信號(hào)通路 研究?jī)?nèi)分泌、旁（自）分泌等信號(hào)分子對(duì)選定基因表達(dá)的調(diào)控作用及對(duì)表觀遺傳學(xué)修飾作用的影響；采用特定細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激動(dòng)劑和阻斷劑處理，研究信號(hào)分子調(diào)控作用的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，探討信號(hào)分子之間可能存在的相互作用模式。 主要研究目標(biāo) 13 建立豬、雞肌肉與脂肪胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞庫(kù)。 建立豬、雞肌肉與脂肪胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化模型。 闡明豬、雞骨骼肌和脂肪干細(xì)胞分化過(guò)程中 3－ 5 種關(guān)鍵基因的功能作用，及其下游信號(hào)通路。 建立 miRNA 雞的培育技術(shù)與方法。 承擔(dān)單位： 廈門大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 袁立 經(jīng)費(fèi)比例： 31％ 課題 非編碼 RNA 在骨骼肌和脂肪組織分化過(guò)程中的分子調(diào)控機(jī)制 主要研究?jī)?nèi)容 肌肉和脂肪相關(guān) miRNA 的鑒定 首先建立具有品系代表性的豬、雞非編碼 RNA 文庫(kù)，鑒 定肌肉和脂肪相關(guān)miRNA 及 miRNA clusters，分別研究其在肌肉和脂肪干細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)模式，確定 miRNA 分子可能調(diào)控的靶基因。 miRNA 對(duì)骨骼肌和脂肪干細(xì)胞增殖、分化的調(diào)節(jié) 在體外培養(yǎng)的原代成肌細(xì)胞（ myoblast）、肌衛(wèi)星細(xì)胞（ satellite cell）、間充質(zhì)細(xì)胞和脂肪前體細(xì)胞中超表達(dá)或 Knockdown 特定 miRNA，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞增殖分化的標(biāo)志基因（ marker）的表達(dá)情況，探討 miRNA 對(duì)成肌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。 主要研究目標(biāo) 建立我國(guó)特征品系畜禽的骨骼肌和脂肪細(xì)胞的 miRNA 文庫(kù)； 確定新發(fā)現(xiàn)的 miRNA 在肌肉