人臍血干細胞移植治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎的研究(編輯修改稿)
2025-02-11 00:47 本頁面
【文章內容簡介】 S18，Olympus）。 方法 EAE大鼠模型的制作 參照林泓怡等［2］所介紹的方法,將豚鼠處死并經75%乙醇浸泡后,無菌條件下迅速取脊髓組織與等量無菌生理鹽水混合勻漿,然后與等體積完全弗氏佐劑制成誘導乳劑。 ml誘導乳劑進行免疫,7 d后再次注射等量乳劑。注射后所有大鼠每天稱體質量，進行神經功能缺損評分；0分：不發(fā)病。1分：尾部肌張力降低或輕度步態(tài)笨拙。2分：尾部無肌張力,和/或中度步態(tài)異常,和/或不能維持姿態(tài)。3分：肢體無力。4分：肢體癱瘓。5分：頻死狀態(tài)?！?分為成功模型。 HUCBCs懸液制備 參照Ha等［3］的方法采集足月新生兒臍帶血60～100 ml,分離臍血單個核細胞,以1106/ml的密度接種于含10 ml DMEM /F12的培養(yǎng)皿中,用Brdu標記,置于含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用PBS反復洗滌離心制備密度為6106/ml的HUCBCs懸液。 HUCBCs的移植 移植前HUCBCs經Brdu(終濃度5 Μmol/L)標記2 d,離心后將其溶于生理鹽水中,調整細胞濃度為6106/ml。在造模后14 d將大鼠麻醉、固定后, Μl細胞懸液，留針5 min后緩慢拔針。對照組用同樣方法注入等量生理鹽水。 免疫組化檢測 分別于HUCBCs移植后7 d、14 d、21 d、28 d隨機處死移植組及對照組各5只大鼠。4%多聚甲醛500 ml經左心室灌注后,斷頭取腦和脊髓,置4%多聚甲醛后固定24 h,冠狀位切取大腦頂葉皮質、側腦室周圍、腦干、小腦皮質及脊髓厚度2 mm的組織標本,石蠟包埋,連續(xù)切片,片厚5 Μm, 進行nestin、Brdu、NSE、GFAP、CNPase 免疫組化染色,觀察移植后大鼠腦和脊髓內HUCBCs的存活、增殖、分化、遷徙狀況。 病理學檢查 取上述各組大鼠各部位腦組織的切片同時行HE染色和麗春紅染色，光鏡下行病灶計數。呈袖套樣改變或＞20個炎性細胞浸潤者為1個脫髓鞘或炎性灶，將各節(jié)段所有病灶相加取均數。 統(tǒng)計學方法 檢測數據以均數177。標準差(177。s)表示,使用SPSS 。 2 結 果 移植組與對照組各時間點神經功能缺損評分的比較 見表1。移植組在移植后1 d、7 d、14 d的神經功能缺損評分與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義,但移植后第21 d、28 d的神經功能缺損評分明顯低于對照組(均P)。表1 移植組與對照組移植后不同時間神經功能缺損評分的比較 注：與對照組比較*Ｐ HUCBCs移植后大鼠腦和脊髓內免疫組化檢測結果 移植后7 d、14 d、21 d、28 d的腦和脊髓組織切片中均可見Brdu染色陽性細胞分布,以側腦室周圍、脊髓白質與軟脊膜靜脈交界處為密集。對同一部位切片Brdu 染色陽性細胞數進行比較, 移植后21 d、28 d明顯多于移植后7 d、14 d(均P), 而7 d與14 d、21 d與28 d之間差異無統(tǒng)計學意義，見表2。各時間點腦和脊髓組織切片均可見nestin染色陽性細胞，移植后7 d大鼠腦和脊髓組織切片中未見GFAP、CNPase及NSE染色陽性細胞，移植后14 d大鼠腦和脊髓組織切片中GFAP、CNPase及NSE均呈弱陽性，移植后21 d、28 d大
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