多次移植骨髓基質(zhì)干細(xì)胞有利于脊髓損傷修復(fù)(編輯修改稿)
2025-02-11 02:42 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 損傷后第7 d BBB評分＜4為納入標(biāo)準(zhǔn)，共60只。隨機分為四組：A 、B、C組（分別為第1周移植1次；第3周移植2次；第5周移植3次組），D組（對照組）。手術(shù)時剪開管口， ml緩慢注入，約5 min， ml PBS液沖管道。 ml PBS。 神經(jīng)功能評價 采用Basso 等［1］提出的大鼠SCI后功能評判標(biāo)準(zhǔn)(BBB 評分法), 總分21分。 由2名熟悉BBB評分標(biāo)準(zhǔn)的非實驗人員觀察。 將動物置于直徑1 m的平面光滑場地自由活動5 min, 記錄動物后肢運動情況。 動物標(biāo)本制備 分別在12周處死動物。大鼠麻醉，左心室穿刺至主動脈，先灌注肝素化的生理鹽水60 mL，再用4%多聚甲醛液進(jìn)行灌注約30 min。 cm的脊髓用4%多聚甲醛液固定24 h。 免疫組織化學(xué)染色 免疫組織化學(xué)方法采用SABC法，其程序按常規(guī)方法進(jìn)行。檢測神經(jīng)干細(xì)胞前體細(xì)胞的標(biāo)記物巢蛋白（Nestine）及神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)記物神經(jīng)絲蛋白（NF200）。 移植細(xì)胞計數(shù) 每個標(biāo)本取損傷中心及頭尾兩端3張切片, 由2名非本課題組并且熟悉BMSCs形態(tài)的實驗人員在200倍熒光鏡下隨機選擇6個不重疊視野觀察、照相計數(shù)，收集數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 軟件包, 所得數(shù)據(jù)以177。s表示,進(jìn)行組間多個樣本均數(shù)的多重比較的單因素方差分析。P，有統(tǒng)計學(xué)意義（圖1）。 2 結(jié) 果 實驗動物數(shù)量分析 各組實驗動物均全部進(jìn)入結(jié)果分析,術(shù)后創(chuàng)傷過重死亡7只,膀胱破裂死亡2只，均予補足。 BMSCs的體外培養(yǎng)與鑒定 從新鮮骨髓中分離獲取的單個核細(xì)胞培養(yǎng)12 h后逐漸出現(xiàn)貼壁細(xì)胞, 其他血細(xì)胞通過換液逐漸棄去, 8～12 d 細(xì)胞90%以上融合,可傳代。傳至第2代后移植，此時貼壁細(xì)胞的特點是呈成纖維細(xì)胞樣, 形態(tài)不一,梭形、多角形或星芒狀突起。 神經(jīng)功能評價 各組大鼠在5 、12周時進(jìn)行BBB 評分。脊髓損傷后1周, 移植組與對照組動物的BBB 評分沒有差異(P)。移植后，隨時間的延長，BBB評分均有增加，功能有恢復(fù)。在術(shù)后3周，移植組均移植1次，BBB評分增加至5～6分。D組與其他三組比較，P, 有統(tǒng)計學(xué)意義。12周后比較，177。,較移植2次評分高4分，較移植1次組評分高7分，與其他3組比較，后肢功能改善明顯，BBB評分增加，P，有統(tǒng)計學(xué)意義（圖1）。 熒光顯微鏡觀察BMSCs結(jié)果 Hoecst33342標(biāo)記的BMSCs細(xì)胞核呈藍(lán)色，移植細(xì)胞大量聚集于損傷區(qū)，7～14 d達(dá)到高峰。移植7周后，移植3次組較移植2次組BMSCs數(shù)量明顯增多，P，有統(tǒng)計學(xué)意義。后隨時間的增加，移植的細(xì)胞逐漸減少（圖3）。移植12周后，移植3次組在損傷區(qū)的剩余BMSCs數(shù)量較其他兩組明顯多，有統(tǒng)計學(xué)意義。P，另外3次移植后細(xì)胞數(shù)并沒有呈倍數(shù)增長，維持在一定的水平。 NF200、Nestin免疫組化結(jié)果 移植BMSCs后，NF在1周后表達(dá)陽性，以損傷區(qū)周圍最多，2周達(dá)到高峰，以后會逐漸減少，尤以損傷區(qū)周圍減少明顯。移植3次組神經(jīng)元樣細(xì)胞減少的速度較其他兩組慢，3個月后仍有較多的NF陽性細(xì)胞（圖4）。移植3次組可見有大量的神經(jīng)絲穿過損傷區(qū)，明顯較移植2次組多，對照組很少有神經(jīng)絲穿過損傷區(qū)。移植的BMSCs在1周后可以轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞前體細(xì)胞的標(biāo)記物Nestin陽性，主要在損傷區(qū)周圍，2周后Nestin陽性細(xì)胞會減少，3周后未見到Nestin陽性細(xì)胞。 3 討 論 BMSCs具有自我更新和多向分化增殖潛能，移植對脊髓損傷的治療作用在不同的實驗研究中已得到了證實，但其作用機制仍在研究中。Harvey等［2］認(rèn)為BMSCs的營養(yǎng)支持及替代作用在治療中起了重要作用。遷移至病變部位的BMSCs同損傷宿主神經(jīng)組織間能夠產(chǎn)生數(shù)種神經(jīng)營養(yǎng)因子,如神經(jīng)生長因子（NGF）、神經(jīng)營養(yǎng)因子3（NT3）、腦源生長因
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