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正文內(nèi)容

多次移植骨髓基質(zhì)干細(xì)胞有利于脊髓損傷修復(fù)(編輯修改稿)

2025-02-11 02:42 本頁面
 

【文章內(nèi)容簡介】 損傷后第7 d BBB評分<4為納入標(biāo)準(zhǔn),共60只。隨機分為四組:A 、B、C組(分別為第1周移植1次;第3周移植2次;第5周移植3次組),D組(對照組)。手術(shù)時剪開管口, ml緩慢注入,約5 min, ml PBS液沖管道。 ml PBS。    神經(jīng)功能評價     采用Basso 等[1]提出的大鼠SCI后功能評判標(biāo)準(zhǔn)(BBB 評分法), 總分21分。 由2名熟悉BBB評分標(biāo)準(zhǔn)的非實驗人員觀察。 將動物置于直徑1 m的平面光滑場地自由活動5 min, 記錄動物后肢運動情況。    動物標(biāo)本制備     分別在12周處死動物。大鼠麻醉,左心室穿刺至主動脈,先灌注肝素化的生理鹽水60 mL,再用4%多聚甲醛液進(jìn)行灌注約30 min。 cm的脊髓用4%多聚甲醛液固定24 h。    免疫組織化學(xué)染色     免疫組織化學(xué)方法采用SABC法,其程序按常規(guī)方法進(jìn)行。檢測神經(jīng)干細(xì)胞前體細(xì)胞的標(biāo)記物巢蛋白(Nestine)及神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)記物神經(jīng)絲蛋白(NF200)。    移植細(xì)胞計數(shù)     每個標(biāo)本取損傷中心及頭尾兩端3張切片, 由2名非本課題組并且熟悉BMSCs形態(tài)的實驗人員在200倍熒光鏡下隨機選擇6個不重疊視野觀察、照相計數(shù),收集數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。    統(tǒng)計學(xué)分析     應(yīng)用SPSS 軟件包, 所得數(shù)據(jù)以177。s表示,進(jìn)行組間多個樣本均數(shù)的多重比較的單因素方差分析。P,有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1)。   2 結(jié) 果    實驗動物數(shù)量分析      各組實驗動物均全部進(jìn)入結(jié)果分析,術(shù)后創(chuàng)傷過重死亡7只,膀胱破裂死亡2只,均予補足。    BMSCs的體外培養(yǎng)與鑒定     從新鮮骨髓中分離獲取的單個核細(xì)胞培養(yǎng)12 h后逐漸出現(xiàn)貼壁細(xì)胞, 其他血細(xì)胞通過換液逐漸棄去, 8~12 d 細(xì)胞90%以上融合,可傳代。傳至第2代后移植,此時貼壁細(xì)胞的特點是呈成纖維細(xì)胞樣, 形態(tài)不一,梭形、多角形或星芒狀突起。    神經(jīng)功能評價     各組大鼠在5 、12周時進(jìn)行BBB 評分。脊髓損傷后1周, 移植組與對照組動物的BBB 評分沒有差異(P)。移植后,隨時間的延長,BBB評分均有增加,功能有恢復(fù)。在術(shù)后3周,移植組均移植1次,BBB評分增加至5~6分。D組與其他三組比較,P, 有統(tǒng)計學(xué)意義。12周后比較,177。,較移植2次評分高4分,較移植1次組評分高7分,與其他3組比較,后肢功能改善明顯,BBB評分增加,P,有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1)。    熒光顯微鏡觀察BMSCs結(jié)果     Hoecst33342標(biāo)記的BMSCs細(xì)胞核呈藍(lán)色,移植細(xì)胞大量聚集于損傷區(qū),7~14 d達(dá)到高峰。移植7周后,移植3次組較移植2次組BMSCs數(shù)量明顯增多,P,有統(tǒng)計學(xué)意義。后隨時間的增加,移植的細(xì)胞逐漸減少(圖3)。移植12周后,移植3次組在損傷區(qū)的剩余BMSCs數(shù)量較其他兩組明顯多,有統(tǒng)計學(xué)意義。P,另外3次移植后細(xì)胞數(shù)并沒有呈倍數(shù)增長,維持在一定的水平。    NF200、Nestin免疫組化結(jié)果     移植BMSCs后,NF在1周后表達(dá)陽性,以損傷區(qū)周圍最多,2周達(dá)到高峰,以后會逐漸減少,尤以損傷區(qū)周圍減少明顯。移植3次組神經(jīng)元樣細(xì)胞減少的速度較其他兩組慢,3個月后仍有較多的NF陽性細(xì)胞(圖4)。移植3次組可見有大量的神經(jīng)絲穿過損傷區(qū),明顯較移植2次組多,對照組很少有神經(jīng)絲穿過損傷區(qū)。移植的BMSCs在1周后可以轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞前體細(xì)胞的標(biāo)記物Nestin陽性,主要在損傷區(qū)周圍,2周后Nestin陽性細(xì)胞會減少,3周后未見到Nestin陽性細(xì)胞。   3 討 論     BMSCs具有自我更新和多向分化增殖潛能,移植對脊髓損傷的治療作用在不同的實驗研究中已得到了證實,但其作用機制仍在研究中。Harvey等[2]認(rèn)為BMSCs的營養(yǎng)支持及替代作用在治療中起了重要作用。遷移至病變部位的BMSCs同損傷宿主神經(jīng)組織間能夠產(chǎn)生數(shù)種神經(jīng)營養(yǎng)因子,如神經(jīng)生長因子(NGF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子3(NT3)、腦源生長因
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