北大現(xiàn)代分子生物學蛋白質(zhì)工程概論(編輯修改稿)
2025-02-09 11:33 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 ?枯草桿菌蛋白酶在少量 H2O2作用下很快失活是由于埋藏在催化部位 Ser221鄰近的 Met222氧化成硫氫化物的原因 。 ? 1985年 Wells證明若用其他氨基酸取代Met222，可以提高酶的氧化穩(wěn)定性而又保持高催化活性 。 ?目前我們已經(jīng)能對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行改造，甚至于能制造出全新的蛋白質(zhì)，這得益于分子生物學理論與技術(shù)的發(fā)展。 ? 20世紀 70年代初期， DNA重組技術(shù)誕生，并成功地應用于基因操作，從而產(chǎn)生了基因工程。 ?而基因工程的誕生， 特別是 DNA重組技術(shù)和定點誘變技術(shù)的建立 ，使我們有可能從基因水平改造蛋白質(zhì)分子中氨基酸的序列，為蛋白質(zhì)工程的誕生，奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。 ? 所謂 基因定點誘變 （ sitedirected mutagenesis），就是在 DNA水平上，在體外試管中通過堿基取代、插入或缺失改變基因 DNA序列中任何一個（或幾個）特定的堿基，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因中某個或某些氨基酸編碼順序加以改變，從而改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的技術(shù)。 ? 該技術(shù)具有簡單易行重復性高等優(yōu)點。它適用于 : ? 基因結(jié)構(gòu)與功能的研究， ? 通過改變基因的密碼子來改造天然蛋白質(zhì)， ? 用于確定蛋白質(zhì)中每一個氨基酸在結(jié)構(gòu)和功能上的作用，為人工改造蛋白質(zhì)提供理論依據(jù)。 ? 寡核苷酸定點誘變技術(shù)所依據(jù)的原理是 : ? 按照體外 DNA重組技術(shù)，將待誘變的目的基因插入到 M13噬菌體上，制備此種含有目的基因的 M13單鏈 DNA，即正鏈 DNA。 ? 再使用化學合成的含有突變堿基的寡核苷酸短片段作引物，啟動單鏈 DNA分子進行復制，隨后這段寡核苷酸引物更新成為新合成的 DNA子鏈的一個組成部分。因此所產(chǎn)生的新鏈便具有已發(fā)生突變的堿基序列，經(jīng)表達即可獲得改造后的蛋白質(zhì)。 ? 為了使目的基因的特定位點發(fā)生突變，所設(shè)計的寡核苷酸引物的序列除了所需的突變堿基外，其余的則與目的基因編碼鏈的特定區(qū)段完全互補。 定點誘變原理示意圖 ?總之，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和動力學研究是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究的重要手段，而改造蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，則依靠基因工程，基因工程的發(fā)展從技術(shù)上提供了改變蛋白質(zhì)個別氨基酸殘基或肽段的手段，使結(jié)構(gòu)改變已能在實驗室實施，二者結(jié)合則產(chǎn)生了蛋白質(zhì)工程。 三、 蛋白質(zhì)工程的研究內(nèi)容 ?（一）利用已知蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的信息作為應用研究 ?（二）定量蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究 ?（三）根據(jù)已知結(jié)構(gòu) 功能的關(guān)系人工改造蛋白質(zhì) （一）利用已知蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的信息作為應用研究 ? 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)的功能和理化性質(zhì)，而蛋白質(zhì)功能區(qū)的某個或某些氨基酸殘基可能在維持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能、理化性質(zhì)中起重要作用。 ? 因此，定點改變這些氨基酸序列，即可能改變蛋白質(zhì)的功能和特性，使之更適合于工業(yè)化生產(chǎn)的要求。 ? 如前所述枯草桿菌蛋白酶之所以易被氧化失活，是由于催化部位的 Ser221鄰近的 Met222易被氧化成硫氫化物，若以其他氨基酸取代 Met222，則可提高酶的氧化穩(wěn)定性而又不影響其催化活性。這是結(jié)構(gòu)分析和定點突變改造蛋白質(zhì)的成功范例。 （二）定量研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 ?這是目前蛋白質(zhì)工程研究的主體。這一類研究的課題很廣泛，包括蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型的建立，配體結(jié)合和酶催化的性質(zhì)，蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性研究，蛋白質(zhì)變異等等。這類研究看起來偏重理論，但對于指導實際工程意義重大。 （三）根據(jù)已知結(jié)構(gòu) 功能關(guān)系人工改造蛋白質(zhì) ?蛋白質(zhì)工程是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和定點改造蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一門學科， 其創(chuàng)造性成就在于開創(chuàng)了按照人類意愿設(shè)計制造符合人類需要的蛋白質(zhì)的新時期。 根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，采用基因定點誘變技術(shù)，人工改造蛋白質(zhì)則是蛋白質(zhì)工程的主要研究內(nèi)容之一。其主要研究內(nèi)容如下： 通過改變蛋白質(zhì)的活性部位，提高其生物功效及獨立工作的能力 ?用定點誘變技術(shù)不僅可以提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，還可以提高酶的活性。要改變酶的活性，需要一個詳細描述了酶的活性位點的圖譜。有了這樣的資料，研究者們即可推測酶與底物的親和程度，并利用定點誘變技術(shù)對蛋白質(zhì)進行改造，提高酶的活性。 ?表 4－ 4 天然和誘變酪氨酰 tRNA合成酶活性 ? 酶 Kcat(s1) Km(mmol/L) Kcat/Km(s1mol1) ? Thr51 ? Ala51 ? Pro51 通過改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)順序，提高其在極端條件（如酸、堿、熱等）下的穩(wěn)定性；例如 : ?蛋白質(zhì)分子中兩個半胱氨酸殘基上的巰基（－ SH）之間氧化脫氫即形成二硫鍵（－Ｓ－Ｓ－）。 ?二硫鍵的數(shù)量與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性有關(guān)，增加蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵，可提高蛋白質(zhì)分子的熱穩(wěn)定
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