北大現(xiàn)代分子生物學(xué)蛋白質(zhì)工程概論-預(yù)覽頁
【正文】 量甚少，用傳統(tǒng)方法分離純化酶蛋白成本太高； ? 酶蛋白分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性差，過酸、過堿、高溫、氧化等因素可破壞其結(jié)構(gòu)，使其喪失生物活性，因而在工業(yè)加工條件下，酶的半衰期短，利用率低； ? 酶催化活性的最適 pH值及底物專一性的范圍較窄，與工業(yè)應(yīng)用的要求有較大差距。 ?定點(diǎn)誘變將編碼鏈上編碼 125位半胱氨酸的密碼子 TGT轉(zhuǎn)換成絲氨酸或丙氨酸的密碼 (TCT或 GCA)，結(jié)果可以避免二硫鍵的錯(cuò)配，使產(chǎn)品 IL2的活性 提高了 7倍 。而蛋白質(zhì)精細(xì)結(jié)構(gòu)的改造，只有利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)才能得以實(shí)現(xiàn)。只有能維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的必須氨基酸及其空間構(gòu)象不變，其功能域的生物學(xué)活性才會保持不變。 ? 20世紀(jì) 50年代末用 X射線晶體學(xué)方法測定了第一個(gè)蛋白質(zhì) —— 肌紅蛋白的結(jié)構(gòu) . ?現(xiàn)已有 400多種蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)被搞清。 ? 2．蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué) ? 線性多肽是如何折疊成具有三維特征的天然結(jié)構(gòu)？蛋白質(zhì)在與其他物質(zhì)（蛋白質(zhì)、核酸或酶的底物等）相互作用時(shí)，其三維結(jié)構(gòu)又是經(jīng)歷怎樣的動(dòng)態(tài)過程而發(fā)揮其活性？只有了解這些問題，才能預(yù)測基因水平的改造最終會對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能產(chǎn)生何種后果，才能談得上具有真正意義的分子設(shè)計(jì)，才能真正的理解生命現(xiàn)象。前者通常為結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定所必需，后者多系分子識別及活性重要部位。 （三）基因工程理論和技術(shù)的發(fā)展，為蛋白質(zhì)的改造和生產(chǎn)提供了必要的技術(shù)手段 ? 、表達(dá)與純化技術(shù)的成熟為提高蛋白質(zhì)得率提供了重要技術(shù)策略 ?隨著基因工程理論和技術(shù)的發(fā)展，人們已經(jīng)能克隆特異蛋白質(zhì)的基因，并令其在適宜宿主菌中表達(dá)，使蛋白質(zhì)的產(chǎn)量大大提高，因而降低蛋白質(zhì)純化成本的問題已基本解決。 ?如野生型枯草桿菌蛋白酶的 218位天冬酰胺(Asn)是酶活性部位有關(guān)的氨基酸殘基，若將其變成 絲氨酸 (Ser)，用 65℃ 的失活半衰期衡量，從 59分鐘增到 223分鐘，酶的穩(wěn)定性顯著增加。 ?目前我們已經(jīng)能對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，甚至于能制造出全新的蛋白質(zhì)，這得益于分子生物學(xué)理論與技術(shù)的發(fā)展。 ? 該技術(shù)具有簡單易行重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)。因此所產(chǎn)生的新鏈便具有已發(fā)生突變的堿基序列，經(jīng)表達(dá)即可獲得改造后的蛋白質(zhì)。 ? 因此，定點(diǎn)改變這些氨基酸序列，即可能改變蛋白質(zhì)的功能和特性，使之更適合于工業(yè)化生產(chǎn)的要求。這一類研究的課題很廣泛，包括蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型的建立，配體結(jié)合和酶催化的性質(zhì)，蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性研究，蛋白質(zhì)變異等等。其主要研究內(nèi)容如下： 通過改變蛋白質(zhì)的活性部位，提高其生物功效及獨(dú)立工作的能力 ?用定點(diǎn)誘變技術(shù)不僅可以提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，還可以提高酶的活性。 ?二硫鍵的數(shù)量與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性有關(guān)，增加蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵，可提高蛋白質(zhì)分子的熱穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。 蛋白質(zhì)工程的程序 ? 分離純化 ~， ? 測定其部分肽段一段結(jié)構(gòu)，根據(jù)編碼原則合成相應(yīng)同位素標(biāo)記的寡苷酸探針 。 五、 蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用 ? （一）研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 ? （二）改變蛋白質(zhì)的特性 ? （三）生產(chǎn)蛋白質(zhì)和多肽類活性物質(zhì) ? （四）設(shè)計(jì)合成全新蛋白質(zhì) （一）研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 ?研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系是按照人類的意愿改造蛋白質(zhì)的特性、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)活性蛋白質(zhì)、甚至設(shè)計(jì)和制造全新蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)。這些都可以通過蛋白質(zhì)工程將酶分子中某個(gè)或某一段氨基酸殘基更換、增加、刪除或修飾來實(shí)現(xiàn)。 （三）生產(chǎn)蛋白質(zhì)和多肽類活性物質(zhì) ? 1．提高酶的產(chǎn)量和創(chuàng)建新型酶 ? 天然酶的產(chǎn)量低、穩(wěn)定性差，限制了酶的開發(fā)利用。如利用基因定點(diǎn)誘變技術(shù)，將 T4溶菌酶的 第 3位異亮氨酸 變成 半胱氨酸 ，后者與第 97位的半胱氨酸形成二硫鍵 ，從而穩(wěn)定了兩個(gè)結(jié)構(gòu)域所形成的活性中心，使酶在高溫下的穩(wěn)定性大大提高。單抗用于臨床疾病治療，效果不盡人意，原因在于目前用于治療的單抗多為小鼠單抗，對人而言是一種異體蛋白， 會引起人產(chǎn)生人抗鼠抗體（ human antimouse antibodies , HAMA），此時(shí)再使用小鼠單抗， HAMA與小鼠單抗結(jié)合后，不但會中和單抗使之失效，還會產(chǎn)生有害的過敏反應(yīng)。 ? 3．設(shè)計(jì)和研制多肽及蛋白質(zhì)類藥物 ?隨著蛋白質(zhì)工程技術(shù)的建立和發(fā)展，醫(yī)藥生物高科技產(chǎn)品也迅速發(fā)展。 ?如重組胰島素的生產(chǎn) . ? 4．設(shè)計(jì)合成全新蛋白質(zhì) ? 根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究結(jié)果，利用計(jì)算機(jī)對信息進(jìn)行分析，通過實(shí)驗(yàn)，即可設(shè)計(jì)出一種預(yù)定空間結(jié)構(gòu)的全新多肽和蛋白質(zhì)分子，再利用基因重組、基因克隆和基因表達(dá)技術(shù)即可制造出具有全新化學(xué)性質(zhì)、生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)。另一項(xiàng)更為新穎的戰(zhàn)略是利用蛋白質(zhì)組合規(guī)律及結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系方面的研究結(jié)果設(shè)計(jì)新的蛋白質(zhì)。 ?但缺乏真核細(xì)胞特有的加工后處理，而且在菌體中表達(dá)的外源蛋白，在原核細(xì)胞中不穩(wěn)定，易被菌體蛋白酶破壞。 ?其主要缺點(diǎn)是不能連續(xù)合成重組蛋白，因?yàn)橹亟M病毒感染昆蟲細(xì)胞或昆蟲幼蟲 45天后，細(xì)胞就裂解，幼蟲即死亡。
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