【正文】 酸酶切割DNA產(chǎn)生的是3’突出的黏性末端，可以用__ T4DNA聚合酶進行3’末端標記。49．RNA分子經(jīng)凝膠電泳后按大小不同分開，然后被轉(zhuǎn)移到一張硝酸纖維素膜(尼龍膜) 上，同一放射DNA探針雜交的技術(shù)稱__ Northern印跡_。5’外切核酸酶_的活性。 (a)由作用于同一DNA序列的兩種酶構(gòu)成 (b)這一系統(tǒng)中的核酸酶都是Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶 (c)這一系統(tǒng)中的修飾酶主要是通過甲基化作用對DNA進行修飾 (d)不同的宿主系統(tǒng)具有不同的限制修飾系統(tǒng)4．Ⅱ型限制性內(nèi)切核酸酶： ( ) (a)有內(nèi)切核酸酶和甲基化酶活性且經(jīng)常識別回文序列 (b)僅有內(nèi)切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一種酶提供 (c)限制性識別非甲基化的核苷酸序列 (d)有外切核酸酶和甲基化酶活性 (e)僅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一種酶提供5．下面有關(guān)限制酶的敘述哪些是正確的?( ) (a)限制酶是外切酶而不是內(nèi)切酶 (b)限制酶在特異序列(識別位點)對DNA進行切割 (c)同一種限制酶切割DNA時留下的末端序列總是相同的 (d)一些限制酶在識別位點內(nèi)稍有不同的點切割雙鏈DNA，產(chǎn)生黏末端 (e)一些限制酶在識別位點內(nèi)相同的位置切割雙鏈DNA，產(chǎn)生平末端6．第一個被分離的Ⅱ類酶是： ( ) (a)EcoK (b)HindⅢ (c)HindⅡ (d)EcoB7．在下列進行DNA部分酶切的條件中，控制那一項最好?( ) (a)反應(yīng)時間 (b)酶量 (c)反應(yīng)體積 (d)酶反應(yīng)的溫度8．在下列試劑中，那一種可以螯合Ca2+離子?( ) (a)EDTA (b)檸檬酸鈉 (c)SDS (d)EGTA9．在下列工具酶中，那一種可以被EGTA抑制活性?( ) (a)S1單鏈核酸酶 (b)末端轉(zhuǎn)移酶 (c)堿性磷酸酶 (d)Bal 31核酸酶10．限制性內(nèi)切核酸酶可以特異性地識別： ( ) (a)雙鏈DNA的特定堿基對 (b)雙鏈DNA的特定堿基序列 (c)特定的三聯(lián)密碼 (d)以上都正確11．下列關(guān)于限制性內(nèi)切核酸酶的表示方法中，正確一項的是( )。酶學測序法的基本原理／優(yōu)點是：( ) (a)堿基與特殊染料間不同的相互作用 (b)一個合成引物的延伸和DNA修復合成的可靠終止 (c)限制性位點與DNA末端標記的相關(guān)性 (d)可同時對DNA雙螺旋的兩條鏈進行測序 (e)反應(yīng)是DNA特異的，RNA不會帶來干擾。外切核酸酶切除 (c)用S1核酸酶切除 (d)用5185。 端不能標記其他類型末端 (d)DNA或RNA必須有539。 (a)DNA聚合酶I，RNA (b)DNA聚合酶I，DNA (c)DNA聚合酶Ⅲ，RNA (d)DNA聚合酶Ⅲ，DNA57．用于核酸分子雜交的探針可以是放射性標記的( ) (a)DNA (b)RNA (c)抗體 (d)抗原58．Southern印跡是用DNA探針檢測DNA片段，而Northern印跡則是：( ) (a)用RNA探針檢測DNA片段 (b)用RNA探針檢測RNA片段 (c)用DNA探針檢測RNA片段 (d)用DNA探針檢測蛋白質(zhì)片段59．用免疫化學法篩選重組體的原理是( ) (a)根據(jù)外源基因的表達 (b)根據(jù)載體基因的表達 (c)根據(jù)mRNA同DNA的雜交 (d)根據(jù)DNA同DNA的雜交 60．隨機引物標記探針，下列各項中哪一項是不正確的?( ) (a)雙鏈DNA、單鏈DNA、RNA都是可以標記的 (b)不需要用Dnase I預處理 (c)反應(yīng)時可用Klenow酶 (d)反應(yīng)時可用DNA聚合酶1 61．在切口移位標記DNA探針時只能使用( ) (a)Klenow酶 (b)DNA聚合酶I (c)DNA聚合酶Ⅱ (d)DNA聚合酶Ⅲ 62．要對一雙鏈的DNA分子進行3185。端聚合(DNA聚合酶參與了細菌修復DNA合成過程)；(2)可延 伸的引物必須能提供游離的339。通過比較所有DNA片段的長度可以得知核苷酸的 序列。中含有一個6bp的Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列，該位點的序列可能是什么? 回文序列是：539。6． 為什么反轉(zhuǎn)錄酶在聚合反應(yīng)中會出錯?由于反轉(zhuǎn)錄酶缺少在E．coli DNA聚合酶中起校正作用的339。539。8． 什么是S1核酸酶作圖(S1 nuclease mapping)? S1核酸酶作圖是一種對RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的末端和剪接位點進行作圖的方法9 YAC載體具有什么樣的功能性DNA序列?為什么在克隆大片段時，YAC具有優(yōu)越 性?YAC帶有天然染色體所有的功能元件，包括一個著絲粒，一個DNA復制起點，兩個端粒。 (1)獨立復制； (2)有選擇標記； (3)有獨特的酶切位點； (4)能轉(zhuǎn)化但不擴散。14． cDNA克隆與基因組克隆有何不同? 基因組克隆包含所有不在cDNA中出現(xiàn)的內(nèi)含子。17． 酵母人工染色體要在酵母細胞中穩(wěn)定存在，必須有哪些基本的結(jié)構(gòu)? (1)著絲粒； (2)端粒； (3)ARS序列。21．假定你分離到一個E．coli的Thy 突變體，并推測有可能是ThyA基因突變。將染色體DNA同引物混合后，進行PCR擴增。為了節(jié)省時間，你略過了這一步， 直接將DNA從凝膠轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。3’外切核酸酶進行切割； (3)DNA聚合酶Ⅲ的5’174。25．什么是Western印跡?它與Southern印跡有什么不同?Western印跡是將蛋白質(zhì)經(jīng)電泳分離后從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上，然后用特異性的抗體進行檢測。基因型是lac．原因是在該密碼子中插入了兩個堿基，造成了移碼突變，所以Lac的基因是缺陷的。請問質(zhì)粒載體的安全條件包括哪幾 個方面?10．為什么野生型的l噬菌體DNA不宜作為基因工程載體?11． 什么是藍白斑篩選法?12． 藍白斑篩選法為什么也會有假陽性?13． M13系列載體具有哪些優(yōu)缺點?14．黏粒載體具有哪些特點與不足?15．輔助噬菌體DNA和相應(yīng)的噬菌粒是如何協(xié)同工作的?16． 如果知道某一基因的功能及其相應(yīng)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列組成，可以通過何種方法 克隆該基因?17． 什么是基因文庫?18． 什么是基因組文庫(genomic library)?構(gòu)建基因組文庫，涉及哪些基本過程?它同遺 傳學上的基因庫有什么不同?19． 什么是cDNA文庫(plementDNAlibrary)?同基因組文庫有何差別?20． 黏性末端連接法是最常用的連接方法，具有許多優(yōu)點，但是也有一些不足，請指出 這些不足之處。32．Northern印跡與Southern印跡有什么不同?33．建立了一個基因文庫后，如何鑒定一個攜帶目的基因的克隆?答案： 1． 答： 限制性內(nèi)切核酸酶采用三字母的命名原則，即屬名+種名+株名的各一個首字母，再加上序號。2． 答： Ⅱ類限制酶雖然識別和切割的序列都具有特異性，但是這種特異性受特定條件的限 制，即在一定環(huán)境條件下表現(xiàn)出來的特異性。黏性末端鏈通常以12176。平末端連接以室溫為宜，因為平末端連接不存在DNA的退火問題，但是溫度高于30℃，連接酶特別不夠穩(wěn)定。E．coli DNA 連接酶需要NAD+作輔助因子，而T4 DNA連接酶需要ATP。539。由于大片段失去了DNA聚合酶I中會降解539。 Klenow酶主要有下列用途： (1)修復反應(yīng)，制備平末端 可用Klenow酶修復限制性內(nèi)切核酸酶或其他方法產(chǎn)生的539。末端標記的探針。539。 (2) 標記DNA339。突出末端，產(chǎn)生339。339。539。C時失活，而BAP68176。但是用CIP處理后，最好將CIP除去后，再進行連接反應(yīng)。磷酸末端，不能切割羥基化539。該酶作用時是行進性的，一步一步進行的。 DNase I有許多用途：(1)在切口移位標記中，制造切口；(2)在足跡法中保護DNA； (3)除去RNA制備物中的DNA；(4)體外轉(zhuǎn)錄中除去DNA模板；(5)檢測染色體中的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)；(6)產(chǎn)生可在噬菌體M13載體上進行測序的隨機克隆。由于多聚體在細胞分裂時將作為一個質(zhì)粒進入一個子細胞，這樣，多聚體的形成就大大降低了質(zhì)粒的有效拷貝數(shù)，因此，多聚體也就大大增加了細胞分裂時質(zhì)粒丟失的機會。如果從質(zhì)粒中將這種區(qū)域拿掉，質(zhì)粒丟失的頻率就會相當高。這兩個模型對于細胞分裂時，質(zhì)粒同質(zhì)膜的結(jié)合是怎樣保證每個細胞至少得到一個質(zhì)粒的解釋是不同的。由于這些位點隨著細胞分裂而分開，每一個質(zhì)?？截悓⒎峙涞揭粋€子細胞。如果我們假定質(zhì)粒結(jié)合的位點不在質(zhì)膜而是在細菌的染色體上就可以了。然后這兩個質(zhì)粒在細胞分裂過程中隨著質(zhì)膜位點的分離而分離。 (3)質(zhì)粒溺愛(plasmid addiction) 即使質(zhì)粒具有分離功能，質(zhì)粒也會從增殖的細胞中丟失。根據(jù)質(zhì)粒的來源不同，毒性蛋白質(zhì)可通過各種方式殺死細胞。 然而，這些其他基因的產(chǎn)物要比毒性蛋白不穩(wěn)定得多，所以它們會很快失活。9．答： (1)非傳遞性和不被帶動轉(zhuǎn)移。 (4)有較小的宿主范圍。 (4)野生型的l噬菌體具有感染性，因此不夠安全。12．答： b—半乳糖苷酶的N末端是非必需的，可以進行修飾，并不影響酶的活性或a肽的互 補性。M13載體的這種性質(zhì)可以用來檢測和選擇產(chǎn)生新的終止密碼或改變可讀框，即移碼突變。 M13克隆系列的不足： (1)較大的外源片段插入后，在擴增過程中往往不夠穩(wěn)定，一般說，克隆的片段越大，發(fā)生丟失的機率越大。 (3)具有l(wèi)噬菌體的包裝和轉(zhuǎn)導特性。如果載體的分子量在5kb的話，得到的轉(zhuǎn)導子幾乎排除由載體自連的可能性，因為要被成功包裝，至少要7個分子的載體自連，盡管如此，也是不能被包裝的，因為COS位點太多了。 (3)包裝過程復雜，包裝效率不穩(wěn)定，代價高。16．答： 可以通過合成核苷酸探針或設(shè)計簡并PCR引物從cDNA文庫或基因組文庫中篩選。為減少所要收集的克隆的數(shù)目，最普遍采用的載體是l噬菌體的一種衍生載體，它可容納12~20kb的供體DNA片段，這點與pBR322不同，它可插入的外源DNA最大約為5kb．18．答： 基因組文庫是用基因工程的方法，人工構(gòu)建的含有某一生物基因組DNA的各種片段 的克隆群。在基因組文庫的構(gòu)建中，由于使用的載體不同，分為噬菌體載體和黏粒載體構(gòu)建的基因組文庫、YAC文庫、BAC文庫等。由于cDNA技術(shù)合成的是不含內(nèi)含子的功能基因，因此是克隆真核生物基因的一種通用方法。20．答： 黏性末端連接法不足之處有：(1)載體易自身環(huán)化；(2)若是用同一種限制性內(nèi)切核酸酶產(chǎn)生的黏性末端連接又不易定向克??；(3)難插入特定的基因；(4)再者就是大片段DNA的重組率較低，即使用堿性磷酸酶處理了載體，防止了載體的自身環(huán)化，載體也有成環(huán)的傾向；(5)用這種方法產(chǎn)生的重組體往往含有不止一個外源片段或不止一個載體連接起來的串聯(lián)重組體，增加篩選工作的困難。以Mg2+作為輔助因子，該酶可以在突出的339。(2)因為載體和外源片段的末端是互補的黏性末端，所以連接效率較高。另外要注意的是，同聚物加尾法同平末端連接法一樣，重組連接后往往會產(chǎn)生某種限制性內(nèi)切核酸酶的切點。用這些限制性內(nèi)切核酸酶處理載體和外源DNA得到的末端可以通過黏性末端連接法連接。所以在這種連接反應(yīng)中不必用堿性磷酸酶進行載體的脫磷反應(yīng)而得到最高的連接效率。對于間斷基因，cDNA可以用外顯子DNA探針通過體外雜交得以鑒定。因此在有四環(huán)素的條件下，環(huán)絲氨酸能夠殺死tetr而不殺死tets的細菌。這三個基本特性是： (1)抗體分子可以牢固地吸附在固體基質(zhì)(如聚乙烯塑料)上而不被洗脫掉； (2)一個抗原可以同幾種不同的抗體結(jié)合； (3)抗體分子可以通過碘化作用被125I標記。DNA或RNA從凝膠向濾膜轉(zhuǎn)移的過程稱為印跡，故此將這種雜交稱為印跡雜交。該法的主要特點是利用毛細現(xiàn)象將DNA轉(zhuǎn)移到固體支持物上，稱為Southern轉(zhuǎn)移或Southern印跡 (Southern blotting)。不過變性方法是不同的，它不能用堿變性，因為堿變性會導致RNA的降解。 (2)探針必須能與所需的基因互補且被32p標記。五、綜合題1．如何以大腸桿菌質(zhì)粒DNA為載體克隆一個編碼動物激素的基因，并使之在大腸桿 菌中進行表達?簡要說明實驗中可能遇到的問題及可能的解決辦法。你并沒有馬上意識到這種方法可行，因為你想到的連接作用需要鄰近的5’磷酸和3’羥基。 (3)你朋友的圖解方法有效嗎?3．打算將一個cDNA克隆到一個表達載體，以便在E．coli中大量制備相應(yīng)的蛋白質(zhì)。由于載體上帶有抗生素的抗性基因，所以，轉(zhuǎn)化的細菌能夠存活。接著又進行了第三次實驗，這次得到了轉(zhuǎn)化子(表22．2)。為確 保分離純化，決定將一段6個組氨酸的短肽加到該蛋白質(zhì)的N端或C端。請設(shè)計一對PCR引物，各含有18個同該基因同源的核苷酸，能夠用于擴增該基因的編碼序列，另外，在N端有一個起始密碼，其后是6個組氨酸密碼子。細菌細胞沒有這樣的機制來去除內(nèi)含子。 ②可以以激素的mRNA為模板用反轉(zhuǎn)錄酶合成激素的基因。 ③有時加工過程可以在離體條