【正文】 出末端是不理想的，改用T4DNA聚合酶或其他的酶是更好的選擇。外切核酸酶的活性，是切割反應(yīng)。突出末端則是用Klenow酶的339。 用Klenow酶修復(fù)539。如在反應(yīng)系統(tǒng)中加入放射性同位素標(biāo)記的脫氧核苷酸，用這種末端填補(bǔ)的方法可以制備339?；?39。外切核酸酶的活性，所以在基因工程中更有用。引物的539。外切核酸酶活性。外切核酸酶的活性，小片段具有539。聚合酶和339。4． 答： Klenow酶是1974年Klenow用枯草桿菌蛋白酶水解DNA聚合酶I，得到兩個(gè)片段，其中大片段的分子量為75kDa，它具有539。 另外反應(yīng)體系中有NH4+離子的存在，對(duì)E．coli DNA連接酶具有激活作用。平末端連接時(shí)連接酶的濃度要比黏性末端連接時(shí)高10100倍。溫度高了難以進(jìn)行末端退火，低于上述溫度會(huì)降低連接酶的活性。C一15176。3． 答： 影響DNA連接酶催化連接反應(yīng)的因素有很多，但溫度對(duì)連接反應(yīng)的影響較大。條件的改變，限制酶的特異性就會(huì)松 動(dòng)，識(shí)別的序列和切割都有一些改變，改變后的活性通常稱第二活性，而將這種因 條件的改變會(huì)出現(xiàn)第二活性的酶的右上角加一個(gè)星號(hào)表示，因此第二活性又稱為星 活性。 順序號(hào)： 若在同一菌株中分離了幾種限制酶，則按先后順序冠以I、Ⅱ、Ⅲ、… 等，用正體。 基本原則： 34個(gè)字母組成，方式是：屬名+種名+株名+序號(hào)； 首字母： 取屬名的第一個(gè)字母，且斜體大寫；第二字母： 取種名的第一個(gè)字母，斜體小寫； 第三字母： (1)取種名的第二個(gè)字母，斜體小寫； (2)若種名有詞頭，且已命名過(guò)限制酶，則取詞頭后的第一字母代替。27． 放射性抗體檢測(cè)法(radioactive antibody test)的基本原理是什么?28． 什么是隨機(jī)引物(random primer)?如何標(biāo)記DNA?29．什么是印跡(blotting)雜交?30．什么是原位菌落雜交(colony hybridization)?31．說(shuō)明Southern雜交的原理和方法。21．什么是同聚物加尾連接法(homopolymer tails joining)?用何種方法加尾?具有哪些優(yōu) 缺點(diǎn)?22．何謂接頭連接法(1inker ligation)?23．什么是同裂酶?為什么說(shuō)用同裂酶進(jìn)行體外重組效率最高?24．為了大量獲得許多用于生化鑒定的產(chǎn)物，你想將擬南芥中的一個(gè)序列已知、編碼單 體酶蛋白的基因在單細(xì)胞微生物中表達(dá)，你如何確保最終能得到產(chǎn)物?25．某一質(zhì)粒載體具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因內(nèi)有一Bgl I的切點(diǎn)。2． 什么是限制性內(nèi)切核酸酶的星號(hào)活性? 受哪些因素影向?3． 影響DNA連接酶催化連接反應(yīng)的因素有哪些?4． 什么是Klenow酶?有哪些活性?在基因工程中有什么作用?5．細(xì)菌堿性磷酸酯酶和小牛腸堿性磷酸酯酶有什么不同?在基因工程中有什么用途?6．λ外切核酸酶(1ambda exonuclease)基本活性是什么?在基因工程中有什么應(yīng)用?7．Mn2+、Mg2+對(duì)Dnase I(deoxyribonuclease ?)的活性有什么影響?Dnase I在基因工程中有什么作用?8．質(zhì)粒如何維持在細(xì)胞中的穩(wěn)定？9．由于基因工程是人為改變遺傳信息的操作，因此必須注意被操作基因的安全，進(jìn)行 嚴(yán)格的監(jiān)控，質(zhì)粒載體的安全性是十分重要的。27．在基因工程中，為了在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)真核生物的基因產(chǎn)物，為什么通常要用cDNA而不用基因組DNA?為什么要在cDNA前加上細(xì)菌的啟動(dòng)子? 這是因?yàn)榧?xì)菌沒(méi)有內(nèi)含子剪接系統(tǒng)，并且不能識(shí)別真核生物的啟動(dòng)子之故。用該酶切割后，用 DNA聚合酶將單鏈末端補(bǔ)齊為雙鏈的平末端，然后重新連接成環(huán)，轉(zhuǎn)化Lac Tets受體菌，篩選Tetr轉(zhuǎn)化子，問(wèn)：Lac的基因型是什么?并說(shuō)明原因。它與Southern的不同在于探針的性質(zhì)不同，在Western印跡中使用的探針是抗體(蛋白質(zhì))。 原因是：HindⅢ的切點(diǎn)在A基因內(nèi)。3’合成酶進(jìn)行修補(bǔ)； (4)在修補(bǔ)過(guò)程中，隨著切口(nick)的移動(dòng)，將放射性的底物摻人到雙鏈DNA中。23．切口移位(nick translation)標(biāo)記探針的主要步驟有哪些? (1)DNaseI造成切口； (2)DNA聚合酶III的5’ 174。然后用標(biāo)記探針雜交，最后發(fā)現(xiàn)放射自顯影片是空白。根據(jù)方案，下面一步驟 是用NaOH溶液浸泡凝膠，使DNA變性為單鏈。然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，純化擴(kuò)增片段，可以直接測(cè)序或克隆到合適的載體再測(cè)序。在引物的5’端加上合適Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列，以便于后來(lái)的克隆。請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì) 一個(gè)方案用PCR從染色體DNA擴(kuò)增突變的ThyA基因，測(cè)定突變的序列。20．欲將一真核生物的結(jié)構(gòu)基因克隆后轉(zhuǎn)移到原核生物(如E．coli)中進(jìn)行表達(dá)，克隆時(shí)應(yīng)注意哪些問(wèn)題?應(yīng)注意的問(wèn)題有：?jiǎn)?dòng)子、密碼子、剪接、分泌。18． 何謂YAC? 主要特性是什么? (1)含有來(lái)自其他生物DNA的酵母人工染色體，叫YAC； (2)主要特性是可以克隆較大的外源片段。 (1)COS位點(diǎn)可以自身環(huán)化； (2)可以利用COS位點(diǎn)包裝l噬菌體顆粒； (3)可以感染寄主細(xì)胞； (4)利用質(zhì)粒復(fù)制子復(fù)制，不整合、不裂解。15． 怎樣將一個(gè)平末端DNA片段插入到EcoR I限制位點(diǎn)中去?化學(xué)合成一些長(zhǎng)為10bp含有EcoRI識(shí)別位點(diǎn)的短的DNA片段，然后與待克隆片段兩端連接起來(lái)，如果用EcoRI切割這種連接片段，就會(huì)產(chǎn)生EcoRI的單鏈末端。 (2)至少要預(yù)先知道足夠合成一對(duì)引物的靶DNA序列。11． 什么叫穿梭載體？ 含有細(xì)菌質(zhì)粒和克隆的真核生物DNA片段的雜種質(zhì)粒，有兩個(gè)復(fù)制起點(diǎn)和既能在細(xì)菌又能在真核細(xì)胞中進(jìn)行選擇的選擇標(biāo)記，所以，很容易從一宿主轉(zhuǎn)到另一個(gè)宿主(來(lái)回穿梭)。10． 列舉質(zhì)粒載體必須具備的4個(gè)基本特性。YAC能夠容納長(zhǎng)達(dá)幾百kb的外源DNA，這是質(zhì)粒和黏粒辦不到的。聚合酶的活性，而且聚合能力提高了3～9倍，測(cè)序時(shí)常用此酶。的外切核酸酶活性，只有539。7． 什么是測(cè)序酶(sequenaseTM)?所謂測(cè)序酶即是修飾了的T7 DNA聚合酶，是采用缺失的方法，從外切核酸酶結(jié)構(gòu)域中除去28個(gè)氨基酸，這樣使T7 DNA聚合酶完全失去了339。539。或使用通用緩沖液。CATATG3，4．下面幾種序列中你認(rèn)為哪一個(gè)(哪些)最有可能是Ⅱ類酶的識(shí)別序列：GAATCG，AAATTT， GATATC， ACGGCA? 為什么?GATATC；AAATTT，因?yàn)樗鼈兪腔匚男蛄?。CGAACATATGGAGT339。2．某學(xué)生在用EcoRI切割外源DNA片段時(shí)，出現(xiàn)了星號(hào)活性，請(qǐng)分析可能的原因?鹽離子濃度不對(duì)，溫度不對(duì)，甘油濃度過(guò)高。如果分別用4種雙脫氧核苷酸終止反應(yīng)，則會(huì)獲 得4組長(zhǎng)度不同的DNA片段。羥基末端，雙脫氧核苷酸由于缺少游離的339。端向339。末端標(biāo)記，可用( ) (a)Klenow酶 (b)DNA聚合酶I (c)T4DNA聚合酶 (d)T7DNA聚合酶答案1．c；2．c； 3．b； 4．b 5．b，C，d，e； 6．c； 7．b； 8．d；9．d； 10．B； 11．d； 12．a(chǎn)； 13．d； 14．b 15．d； 16．c；17．a(chǎn)，b；18．a(chǎn)；19．c；20．d；21．c；22．C； 23．b； 24．C；25．d；26．a(chǎn)，C，d；27．b；28．c； 29．b；30．a(chǎn)；31．c； 32．a(chǎn),c,d,e， 33．a(chǎn)，b，c；34．b； 35．c；36．c； 37．d； 38．b；39．c；40．a(chǎn)；41．c； 42．a(chǎn)，b，c； 43．b； 44．b； 45．d； 46．a(chǎn)；47．a(chǎn)； 48．c； 49．c；50．b；51．c； 52．c； 53．b； 54．a(chǎn),c,d；55．a(chǎn)； 56．b；57．a(chǎn)，b； 58．c；59．a(chǎn)；60．d；61．b； 62．c；三、簡(jiǎn)答題1．說(shuō)明Sanger DNA測(cè)序法的原理。 (a)Southem印跡雜交 (b)Northem印跡雜交 (c)Western印跡 (d)原位菌落雜交53．下列哪一個(gè)不是Southern印跡法的步驟?( ) (a)用限制酶消化DNA (a)DNA與載體的連接 (c)用凝膠電泳分離DNA片段 (d)DNA片段轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上 (e)用一個(gè)標(biāo)記的探針與膜雜交54． 報(bào)告基因( ) (a)以其易于分析的編碼序列代替感興趣基因的編碼序列 (b)以其易于分析的啟動(dòng)子區(qū)代替感興趣基因的啟動(dòng)子區(qū) (c)能用于檢測(cè)啟動(dòng)子的活性 (d)能用于確定啟動(dòng)子何時(shí)何處有活性55． 在利用lacZ失活的顯色反應(yīng)篩選法中，IPTG的作用是( ) (a)誘導(dǎo)宿主的α肽的合成 (b)誘導(dǎo)宿主的ω肽的合成 (c)作為酶的作用底物 (d)作為顯色反應(yīng)的指示劑56. 切口移位是指在( )作用下，使( )帶上放射性標(biāo)記。OH的存在51．Southem印跡的DNA探針( )雜交。 (a)既能標(biāo)記DNA，又能標(biāo)記RNA (b)既能標(biāo)記雙鏈DNA又能標(biāo)記單鏈DNA (c)只能標(biāo)記突出的539。外切核酸酶切除42．在DNA的酶切反應(yīng)系統(tǒng)中，通常：( ) (a)用SSC緩沖液 (b)加入Mg2+作輔助因子 (c)加入BSA等保護(hù)劑 (d)上述說(shuō)法中，有兩項(xiàng)是正確的43． 黏性末端連接法，不僅操作方便，而且( ) (a)產(chǎn)生新切點(diǎn) (b)易于回收外源片段 (c)載體不易環(huán)化 (d)影響外源基因的表達(dá)44．在下列表型中，( )是基因工程上理想的受體菌表型 (a)r+m+rec* (b)rmrec (C)rmrec+ (d)r+m+rec45．關(guān)于DNA接頭在基因工程中的作用，下列說(shuō)法中哪一項(xiàng)不正確?( ) (a)給外源DNA添加適當(dāng)?shù)那悬c(diǎn) (b)人工構(gòu)建載體 (c)調(diào)整外源基因的可讀框 (d)增加調(diào)控元件46．cDNA文庫(kù)包括該種生物的( ) (a)某些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因 (b)所有蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因 (c)所有結(jié)構(gòu)基因 (d)內(nèi)含子和調(diào)控區(qū)47．下列關(guān)于建立cDNA文庫(kù)的敘述中，哪一項(xiàng)是錯(cuò)誤的?( ) (a)從特定組織或細(xì)胞中提取DNA或RNA (b)用反轉(zhuǎn)錄酶合成mRNA的對(duì)應(yīng)單鏈DNA (c)以新合成的單鏈DNA為模板合成雙鏈DNA (d)新合成的雙鏈DNA甲基化 48．下列對(duì)黏性末端連接法的評(píng)價(jià)中，哪一項(xiàng)是不正確的? ( ) (a)操作方便 (b)易于回收片段 (c)易于定向重組 (d)載體易于自身環(huán)化，降低重組率49．關(guān)于感受態(tài)細(xì)胞性質(zhì)的描述，下面哪一種說(shuō)法不正確?( ) (功具有可誘導(dǎo)性 (b)具有可轉(zhuǎn)移性 (c)細(xì)菌生長(zhǎng)的任何時(shí)期都可以出現(xiàn) (d)不同細(xì)菌出現(xiàn)感受態(tài)的比例是不同的50．下面關(guān)于用T4多核苷酸激酶標(biāo)記539。在下列文庫(kù)中， ( )屬cDNA文庫(kù) (a) YAC文庫(kù) (b) MAC文庫(kù) (c) 扣減文庫(kù) (d) BAC文庫(kù)40．下面關(guān)于多克隆位點(diǎn)(multiple clone site,MCS)的描述，不正確的—句是( ) (a)僅位于質(zhì)粒載體中 (b)具有多種酶的識(shí)別序列 (c)不同酶的識(shí)別序列可以有重疊 (d)一般是人工合成后添加到載體中41．在cDNA技術(shù)中，所形成的發(fā)夾環(huán)可用( ) (a)限制性內(nèi)切核酸酶切除 (b)用3185。這樣既減少純化步驟，也節(jié)約了開支。 (a)5，3，合成酶， (b)3，5，外切酶 (c)5，3，外切酶 (d)轉(zhuǎn)移酶22． 下面關(guān)于松弛型質(zhì)粒(relaxed plasmid)性質(zhì)的描述中，( )是不正確的 (a)質(zhì)粒的復(fù)制只受本身的遺傳結(jié)構(gòu)的控制，而不受染色體復(fù)制機(jī)制的制約， 因而有較多的拷貝數(shù) (b)可以在氯霉素作用下進(jìn)行擴(kuò)增 (c)通常帶有抗藥性標(biāo)記 (d)同嚴(yán)緊型質(zhì)粒融合后，雜合質(zhì)粒優(yōu)先使用松弛型質(zhì)粒的復(fù)制子 23． 基因工程中所用的質(zhì)粒載體大多是改造過(guò)的，真正的天然質(zhì)粒載體很少，在下列載 體中只有( )被視為用作基因工程載體的天然質(zhì)粒載體 (a)pBR322 (b)pSCl01 (c)pUBll0 (d)pUCl8 24． 下列哪種克隆載體對(duì)外源DNA的容載量最大?( ) (a)質(zhì)粒 (b)黏粒 (c)酵母人工染色體(YAC) (d) l噬菌體 (e) cDNA表達(dá)載體 25. 松弛型質(zhì)粒： ( ) (a)在寄主細(xì)胞中拷貝數(shù)較多 (b)可用氯霉素?cái)U(kuò)增 (c)一般沒(méi)有選擇標(biāo)記 (d)上述(a)、(b)兩項(xiàng)正確 26．Col El是惟一用作基因工程載體的自然質(zhì)粒，這種質(zhì)粒： ( ) (a)是松弛復(fù)制型 （b)具有，四環(huán)素抗性 (c)能被氯霉