北大現(xiàn)代分子生物學(xué)蛋白質(zhì)工程概論-文庫吧
2024-12-29 11:33 本頁面
【正文】 證明， IL2是由 133個氨基酸殘基組成的多肽，有 3個半胱氨酸， 1個二硫鍵，而 125位上的半胱氨酸處于游離狀態(tài) ，在分離純化 IL2的過程中，易發(fā)生二硫鍵錯配，致使整個多肽活性降低。 ?定點(diǎn)誘變將編碼鏈上編碼 125位半胱氨酸的密碼子 TGT轉(zhuǎn)換成絲氨酸或丙氨酸的密碼 (TCT或 GCA)，結(jié)果可以避免二硫鍵的錯配，使產(chǎn)品 IL2的活性 提高了 7倍 。 ?再如 :單克隆抗體是很有希望的疾病治療用藥 ,但是 ,單克隆抗體技術(shù)建立起已有數(shù)十年 ,并早已認(rèn)識到其藥用價值 ,但至今應(yīng)用不佳 ,原因是鼠源單抗對人來說是異體蛋白。其人源化改造需蛋白質(zhì)工程才能完成。 ?可見，改造蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)以改變蛋白質(zhì)的某些生物學(xué)特性，在拓寬蛋白質(zhì)的用途，推動生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化方面至關(guān)重要。而蛋白質(zhì)精細(xì)結(jié)構(gòu)的改造，只有利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)才能得以實(shí)現(xiàn)。 （二）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究技術(shù)的建立推動了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究，從而為蛋白質(zhì)改造提供了理論依據(jù) ? 蛋白質(zhì)工程的重要目標(biāo)之一，是通過改造蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)來提高其開發(fā)利用的價值。這就是說，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變了，其生物學(xué)功能不能變。 ? 研究表明，蛋白質(zhì)功能部位的幾個氨基酸殘基決定著蛋白質(zhì)的功能，但是這幾個負(fù)責(zé)功能的氨基酸殘基必須處于一個極其精密的空間狀態(tài)下才能發(fā)揮功能。只有能維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的必須氨基酸及其空間構(gòu)象不變，其功能域的生物學(xué)活性才會保持不變。 ? 因此在對蛋白質(zhì)進(jìn)行改造之前必需對其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系進(jìn)行充分地研究，了解影響蛋白質(zhì)特性的氨基酸或氨基酸序列是哪些？改變這個（些）氨基酸是否會影響蛋白質(zhì)的功能？ ? 闡明蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，進(jìn)而研究其與生物學(xué)功能的關(guān)系已成為了解生命現(xiàn)象的關(guān)鍵，并成為蛋白質(zhì)工程的基礎(chǔ)。 ? 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究技術(shù)主要包括蛋白質(zhì)晶體學(xué)、蛋白質(zhì)動力學(xué)、生物信息學(xué)等。 ? 1．蛋白質(zhì)晶體學(xué) ?蛋白質(zhì)晶體學(xué)（ protein crystallography）是利用 X射線衍射法（ Xray diffraction method）的原理解釋蛋白質(zhì)晶體中的原子在空間的位臵與排列，并了解其與功能的關(guān)系。 ? 20世紀(jì) 50年代末用 X射線晶體學(xué)方法測定了第一個蛋白質(zhì) —— 肌紅蛋白的結(jié)構(gòu) . ?現(xiàn)已有 400多種蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)被搞清。 ?通過蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的研究有助于了解蛋白質(zhì)是如何發(fā)揮生物學(xué)功能的。 ?近年來又發(fā)展了 核磁共振（ NMR）技術(shù) ，它是確定蛋白質(zhì)分子在溶液中結(jié)構(gòu)信息廣為使用的方法。核磁共振技術(shù)使用較低強(qiáng)度輻射能測定蛋白質(zhì)分子在流動化液態(tài)下的三維結(jié)構(gòu)信息，從而更真實(shí)地反映蛋白質(zhì)在生物環(huán)境下的結(jié)構(gòu)信息，并能確定小分子與大分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。 ? 2．蛋白質(zhì)動力學(xué) ? 線性多肽是如何折疊成具有三維特征的天然結(jié)構(gòu)？蛋白質(zhì)在與其他物質(zhì)（蛋白質(zhì)、核酸或酶的底物等）相互作用時，其三維結(jié)構(gòu)又是經(jīng)歷怎樣的動態(tài)過程而發(fā)揮其活性？只有了解這些問題，才能預(yù)測基因水平的改造最終會對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能產(chǎn)生何種后果，才能談得上具有真正意義的分子設(shè)計(jì)，才能真正的理解生命現(xiàn)象。蛋白質(zhì)動力學(xué)正是研究這一課題的。 ? ? 生物信息學(xué) 的神速發(fā)展為蛋白質(zhì)動力學(xué)的研究提供了方便有效的技術(shù)。 ? 生物信息學(xué)是利用計(jì)算機(jī)控制的 圖像顯示系統(tǒng) ，把所要研究蛋白質(zhì)的已知三維結(jié)構(gòu)顯示在屏幕上，分析哪些殘基對 分子內(nèi) 相互作用可能是重要的，哪些殘基對 分子間 相互作用可能是重要的。前者通常為結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定所必需，后者多系分子識別及活性重要部位。 ? 然后通過計(jì)算機(jī)按預(yù)先設(shè)想替換一些側(cè)鏈基團(tuán)，再用計(jì)算機(jī)尋找經(jīng)過“微擾”后蛋白質(zhì)分子的能量趨于極小的狀態(tài)，預(yù)測由于這種替換可能造成的后果。 ? 生物信息學(xué)是蛋白質(zhì)工程研究必不可少的。目前已有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與特性分析所需的生物信息數(shù)據(jù)庫，可供選擇。 （三）基因工程理論和技術(shù)的發(fā)展，為蛋白質(zhì)的改造和生產(chǎn)提供了必要的技術(shù)手段 ? 、表達(dá)與純化技術(shù)的成熟為提高蛋白質(zhì)得率提供了重要技術(shù)策略 ?隨著基因工程理論和技術(shù)的發(fā)展，人們已經(jīng)能克隆特異蛋白質(zhì)的基因，并令其在適宜宿主菌中表達(dá)，使蛋白質(zhì)的產(chǎn)量大大提高，因而降低蛋白質(zhì)純化成本的問題已基本解決。重要的問題是提高酶蛋白的穩(wěn)定性，改良其生物學(xué)特性。 ? 為改造蛋白質(zhì)的特性提供了技術(shù)策略 ? 穩(wěn)定蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的主要因素是蛋白質(zhì)分子眾多基團(tuán)間的相互作用，如 肽鍵、氫鍵、靜電作用、 疏水殘基間的 疏水鍵以及 二硫鍵 等。 ? 研究表明，上述穩(wěn)定蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的因素是由蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中某一個或某一段氨基酸序列決定的，人工改變或修飾這些氨基酸殘基，有可能增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，又不影響其生物學(xué)活性。 ?如野生型枯草桿菌蛋白酶的 218位天冬酰胺(Asn)是酶活性部位有關(guān)的氨基酸殘基，若將其變成 絲氨酸 (Ser)，用 65℃ 的失活半衰期衡量，從 59分鐘增到 223分鐘，酶的穩(wěn)定性顯著增加。 ?再如氧化失活使枯草桿菌蛋白酶在工業(yè)上的應(yīng)用受到嚴(yán)重限制。
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