【文章內(nèi)容簡介】 的淋巴細胞混合培養(yǎng)，通過血凝素親和柱色譜將細胞分離，用激光共焦熒光顯微鏡和流式細胞儀確定細胞類型，用流式細胞儀和甲基四唑確定細胞的存活能力。結(jié)果表明： antiCD 抗體偶聯(lián)量子點可以提高磺化鋁酞菁染料(SALPC)在 UV 照射下對 白血病 細胞的殺傷效果，這是由于 CdSe 量子點在光照作用下產(chǎn)生自由基，并且釋放游離 Cd2+而引起的。這 僅僅只是一個初步的結(jié)果，在量子點真正用于癌癥治療之前，必需對量子點在體內(nèi)的吸收、代謝、毒性做一個全面的了解，減小其在治療中的副作用。 量子點的 生物效應 研究 量子點在臨床診斷、治療以及生物學領域有著廣闊的應用前景，但其生物安全性目前還沒有定論，在把它應用于人體和其它生物體之前，應該首先了解它的生物效應。 Derfus等人[58]以肝細胞為模型，研究了 CdSe 量子點的生物效應。他們發(fā)現(xiàn) CdSe 量子點在一定的條件下會表現(xiàn)出明顯的毒性，其毒性與合成過程、表面修飾和紫外光照有關，他們認為其細胞毒性與 CdSe晶格所釋放的 Cd2+有聯(lián)系，表面修飾物質(zhì)的不同可以不同程度的阻止 Cd2+的釋放，起到降低毒性的作用；而紫外光照將催化量子點表面氧 化，釋放 Cd2+。 Hoshino等人 [59]報道了采用不同分子修飾的量子點的潛在細胞毒性，發(fā)現(xiàn)表面修飾改變了它們的物理化學性質(zhì)，其毒性與量子點本身無關而與表面修飾分子有關。 Kirchner 等人 [60]研究了 CdSe 量子點及CdSe/ZnS核 殼結(jié)構(gòu)量子點的細胞 毒性 ，他們用巰基丙酸、硅微球和高分子微球分別修飾量子點并與 細胞 混合培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：這些功能化的量子點除釋放 Cd2+外，其表面化學性質(zhì)對細胞也有很大的影響，量子點可以吸附在細胞表面并對細胞造成傷害。不同試劑修飾的量子點其細胞毒性也不相同。 Green 和 Howman[61]研究了水溶性 CdSe/ZnS 量子點和超螺旋DNA的相互作用，發(fā)現(xiàn) CdSe/ZnS量子點核 殼型量子點能損傷 DNA，他們認為這種損傷是由于 CdSe/ZnS量子點產(chǎn)生自由基所致。 前景與展望 由于量子點在細胞生物學、醫(yī)學診斷及治療等方面有著廣闊的應用前景和商業(yè)價值，很多科學家都加入到這方面的研究中來，并取得了很大的進展。但目前仍有一些問題有待解決：(1)如何進一步阻止量子點熒光在水溶液中的猝滅； (2)發(fā)展一些簡單可靠的方法將量子點與特定的分子結(jié)合； (3)在分析過程中防止量子點的 非特異結(jié)合及團聚； (4)進一步開展量子點生物毒性研究； (5)發(fā)展一種簡單、通用的方法將功能化量子點轉(zhuǎn)移到細胞中。可以預計，在不遠的將來，多功能的量子點探針在腫瘤診斷和治療中將扮演重要的角色。利用這些探針對癌細胞進行捕獲及定位，將可能實現(xiàn)癌癥的早期診斷及治療；將量子點編碼微球與不同的靶分子結(jié)合，可實現(xiàn)高通量藥物篩選、藥物示蹤及尋找新的藥物。 納米金及其在醫(yī)學診斷中的應用 引言 納米金是指金的微小顆粒 (直徑 1100nm)，一般為分散在水中的水溶膠， 又稱膠體金 [62]。受電子能級躍 遷和表面等離子體共振的影響，納米金的顏色隨其粒徑大小的不同而呈現(xiàn)紅色到紫色的變化 [63]。利用還原劑 (如：白磷、抗壞血酸、硼氫化鈉、檸檬酸鈉等 )可將氯金酸還原，制得納米金。其中，檸檬酸鈉還原法因制備簡單而應用較多 [62]。 受相互間誘導偶極的影響，納米金的凝聚會引起溶液的顏色變化，且 這種變化依賴于納米金顆粒之間的距離和凝聚體的大小 [64]。利用分析物能誘導納米金凝聚的特性，可將納米金用于 DNA、蛋白質(zhì)、糖類等生物分子的檢測及相關疾病的診斷，為此，人們對表面功能化的 納米金 給予了廣泛的興趣并進行了深入的研究。本 節(jié)將從分析檢測和醫(yī)學診斷的角度對DNA功能化的納米金、蛋白質(zhì)功能化的納米金以及 糖功能化的納米金診斷試劑 進行簡單介紹。 DNA功能化的納米金診斷試劑 DNA序列的檢測在疾病診斷和致病基因的研究等方面具有潛在的應用價值，為此，日益受到人們的重視。以酶標記、放射性同位素標記、熒光標記、化學發(fā)光標記及其它探針標記技術(shù)為基礎，已建立了許多有關 DNA序列的檢測方法。但是，這些方法往往存在著靈敏度低、重現(xiàn)性差、過程復雜、儀器昂貴、污染環(huán)境等缺點或不足，因而在應用方面受到了很大的限制 [65]。正因為如此， Mirkin課題組 [66, 67]建立了用烷巰基化寡核苷酸探針標記納米金并用于檢測 DNA序列的新方法 ， 該法具有 以下優(yōu)點： (1)雜交體系的“熔點曲線”很陡 ， 熔解溫度的范圍很窄 ， 通過調(diào)節(jié)溫度即可辨別互補、錯配、缺失、插入等各種不同情況下的 DNA靶片段，選擇性很高； (2)未優(yōu)化的體系即可檢測出 1014mol/L的 DNA靶片段 ，應用金標 銀染法可將信號放大 105倍 ，使 檢測的靈敏度大大提高； (3)檢測過程快速、簡便，無需特殊、昂貴的儀器設備 [68]。 不論是基于光學還是電化學方法的 DNA檢測及相關疾病的診斷，都要先制 得納米金標寡核苷酸探針。 Mirkin 課題組 [66, 67]先將寡核苷酸探針烷巰基化、再與納米金偶聯(lián)的方法，被人們普遍采用。值得注意的是，在合成烷巰基化寡核苷酸探針時，在靠近烷巰基的一端往往要留出一定數(shù)目的堿基作為連接臂，其余的堿基則是與 DNA靶片段互補的序列。合成好的烷巰基化寡核苷酸探針脫去保護基團后，用反相高效液相色譜進行純化，再與納米金溶液按一定比例混合、孵育，并置于緩沖溶液中保持一段時間后，經(jīng)離心、洗滌等一系列后處理步驟即可在納米金顆粒表面修飾好烷巰基化寡核苷酸探針。 光學 檢測及其 診斷 納米金的最大吸收波長依賴于顆粒之間的距離和凝聚體的大小。單分散納米金和標記有寡核苷酸探針的納米金呈紅色 。 而當 DNA靶序列與納米金標寡核苷酸探針雜交后，通過 DNA 圖 10－ 7 納米金標銀染加強的三明治雜交分析法用于 DNA檢測 [69]。 片段的相互聯(lián)結(jié)， 納米 金會形成延伸的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) ，于是 體系的吸收峰發(fā)生紅移 ， 顏色變?yōu)樽霞t色。隨著凝聚體的繼續(xù)增大 ， 這種紅移將使體系的顏色最終變?yōu)樗{色 [68]?；谝陨瞎鈱W原理，納米金標寡核苷酸探針 DNA雜交體系可用于 DNA靶序列的檢測。 基因芯片可對微量樣品中的核酸序列信息進行準確、快速、高通量的檢測與分析 ， 是進行分子生物學研究和核酸診斷的 有力工具 [68]。 Mirkin課題組 [69]采用三明治雜交分析法，使DNA靶序列的兩端分別與固定在基因芯片上的寡核苷酸捕獲探針和納米金標寡核苷酸探針互補、雜交 ， 產(chǎn)生粉紅色斑點 ，經(jīng) 銀染法加強顯色，通過目視化觀察灰度，即可定量研究DNA靶序列的雜交及單堿基錯配的情況 (見圖 10－ 7)。 在 Mirkin課題組研究工作的啟發(fā)下，國內(nèi) 不少研究者利用納米金特定的光學性質(zhì)，將金標銀染加強的 DNA雜交分析法與基因芯片技術(shù)相結(jié)合，用于 DNA的目視化檢測和疾病的診斷。例如， 龐代文 課題組 [65, 70]利用自制的肝炎病毒基因芯片， 目視化檢測病人血清樣本中的 HBV和 HCV基因型，該法具有靈敏度高、專一性強、操作簡單、檢測迅速、價格低廉等優(yōu)點，有望用于肝炎疾病的臨床診斷。 李軼杰等人 [71]將固定在硅烷化片基上的寡核苷酸捕獲探針與單鏈人乳頭瘤病毒 16型新疆株 E6(HPV16E6)基因 的 擴增片斷相結(jié)合 ， 再與互補的納米金標寡核苷酸探針雜交 ， 經(jīng)銀染加強顯色，目視化檢測 HPV16E6基因，該法快速、靈敏，為進一步應用于臨床宮頸癌的早期診斷提供了技術(shù)支持。另外， 劉和平等人 [72]將 生物素化的 DNA靶序列與生物芯片上的捕獲探針雜交，利用生物素 親和素 之間特異性的作用，與親和素修飾的納米金結(jié)合后，經(jīng)銀染法目視化鑒定了大腸桿菌的 4種血清型， 該法簡單、方便 ，無需 復雜的儀器， 適合于普通實驗室的常規(guī)檢測 ， 更能滿足現(xiàn)場檢測的需要 ，故可 用于某些傳染病的早期診斷與監(jiān)控。 另有不少研究者在 核酸的超靈敏檢測 方面進行了積極地探索，并取得了良好的效果。例如， He等人 [73]將納米金加強的表面等離子體共振用于 DNA陣列分析及寡核苷酸的超靈敏檢測，其檢測限為 10pmol/L，即使不進行優(yōu)化，該法的靈敏度也可與傳統(tǒng)的熒光法相媲美。Storhoff等 [74]將 DNA雜交分析法與散射法 相結(jié)合，使雜交反應在均相中進行，無需靶擴增和信號擴增即可檢測出 DNA靶序列，是一種簡單 、廉價的核酸診斷方法。 當納米金表面吸附有檸檬酸根等陰離子時，受負電荷間排斥力的影響，納米金不會發(fā)生凝聚。若向體系中加入雙鏈寡核苷酸，由于雙鏈寡核苷酸上的磷酸根帶負電荷，會與檸檬酸根相互排斥，因此它無法吸附到納米金的表面；相反，單鏈寡核苷酸能靈活伸展其堿基，堿基與納米金之間相互吸引，于是單鏈寡核苷酸在納米金的表面得以吸附。 Li和 Rothberg[75]正是基于以上納米金 與寡核苷酸之間靜電相互作用的 原理，設計了一種 DNA分析的 新方法，該法具有以下特點： (1)靜電吸附，無需 共價修飾 納米金、探針或目的 DNA； (2)雜交與檢測階段分離 ； (3)目視化觀察目的產(chǎn)物的顏色變化， 簡單、快速 (5min)、檢測限低 (1013mol)。 電化學檢測及其診斷 除光學方法外，也可用電化學方法進行 DNA 的檢測。 例如 ，將 DNA 靶序列固定在特定的電極上，與寡核苷酸修飾的納米金標探針雜交，通過溶出伏安法測定溶解的金屬離子的濃度，即可檢測出 [76, 77]， Authier等人 [78]運用該法已成功測得 人細胞 巨化病毒 (HCMV)的單鏈 DNA靶序列。 Lee等 [79]用電沉積銀的方法來擴增 DNA 雜交分析的信號，該法簡單、快速、重現(xiàn)性好、選擇性和靈敏度都很高，在臨床診斷和環(huán)境監(jiān)測等方面具有潛在的應用價值。而 Lin等人 [80]將納米金固定到石英晶體微天平 (QCM)上，經(jīng)寡核苷酸連接后，與溶液中的 DNA 靶序列雜交，并通過 QCM 頻率的變化來監(jiān)測上述 DNA 的固定與雜交過程，研究表明，該法重現(xiàn)性好、靈敏度高，為 DNA傳感器的制作及臨床應用奠定了基礎。 DNA 序列上的核苷酸突變可能會導致疾病的產(chǎn)生，研究這些核苷酸的突變對疾病的臨床診斷和治療將產(chǎn)生深遠的影響。在臨床診斷中 ，單 核苷酸多態(tài)性 (SNP)可作為識別疾病基因的遺傳生物標志 [81]。 由于傳統(tǒng)技術(shù)無法確定所有可能的 SNP，并在靈敏度、檢測速度、價格等方面需要進一步地完善，為此， Kerman等人 建立了對 SNP組合進行區(qū)分和編碼的新方法，并對與腫瘤壞死因子 α(TNFα)有關的 DNA探針所有可能的突變形式進行了編碼。研究表明，單堿基修飾的納米金不僅能顯示 SNP的存在，還能確定突變堿基的類型 [82]。 蛋白質(zhì)功能化的納米金診斷試劑 自從 1971年， Faulk等開創(chuàng)免疫 納米金標記技術(shù)以來，該技術(shù)在生物學、醫(yī)學等眾多領域得到了應用。這是因為： (1)納米金對蛋白質(zhì)的吸附能力較強，使得蛋白質(zhì)的標記過程更加簡單，且標記后的蛋白質(zhì)不易失活，同時納米金也處于更穩(wěn)定的狀態(tài)，有利于長期保存；(2)通過制備不同粒徑的納米金，可進行蛋白質(zhì)的多重標記； (4)檢測速度快，且納米金和檢測樣本的用量都很少 [62]。 目前，與納米金成功實現(xiàn)偶聯(lián)的蛋白質(zhì)主要有抗體、酶等。隨著蛋白質(zhì)類型及 分析檢測方法的不同， 偶聯(lián)方法會有所不同，但總體來說有兩種 。 一種是直接偶聯(lián)，即利用蛋白質(zhì)分子半胱氨酸殘基上的巰基，通過共 價作用實現(xiàn)免疫球蛋白 (IgG)、 血清白蛋白等與納米金的連接 [83]；或調(diào)節(jié)體系的 pH值，使蛋白質(zhì)分子帶正電，通過靜電吸附至帶負電的納米金表面，該法在電化學傳感器的制備中應用較廣 [8489]。 另一種 是間接偶聯(lián)，即通過化學方法使蛋白質(zhì)分子衍生出巰基基團 [83]，再與納米金偶聯(lián)；或?qū)⒓{米金表面進行改性 ，再用偶聯(lián)劑 (如：戊二醛 [90]、 1乙基 3[3(二甲氨基 )丙基 ]碳二亞胺 (EDC)/N羥基琥珀酰亞胺 (NHS)[91]等 )實現(xiàn)蛋白質(zhì)與納米金的連接。 而 Zhou等研究者 [92]另辟蹊徑，運用蛋白質(zhì)原位氧化還原 技術(shù)，制得了納米金 蠶絲蛋白的結(jié)合物。 在 納米金與蛋白質(zhì)的 偶聯(lián)過程中，有以下問題值得注意： (1)為避免蛋白質(zhì)分子失活，需選擇適當?shù)木彌_體系，通常使用磷酸鹽緩沖溶液（ PBS）； (2)對 溫度、濃度、 pH值等偶聯(lián)條件需進行優(yōu)化； (3)為避免或減輕蛋白質(zhì)的 非特異性吸附，需用 牛血清白蛋白 (BSA)、 聚乙二醇 (PEG)或辣根過氧化物酶 (HRP)等物質(zhì) 封閉蛋白質(zhì)可能的活性位點。 光學 檢測及其診斷 將納米金與預先精制的抗體混合，可制得納米金 抗體復合體，利用抗原 抗體特異性結(jié)合的反應，可對抗原進行快速檢 測。由于間接法比直接法的靈敏度更高，目前，人們較多采用先將抗體與抗原反應、再與納米金標二抗結(jié)合的方法檢測抗原。斑點金免疫滲濾試驗正是基于“抗原 抗體 二 抗 納米金”夾心法，將納米金凝聚時所伴隨的顏色變化在固相載體上顯示出來，人通過肉眼觀察，即可判斷反應是否呈陽性 [62]。 早孕診斷就是該技術(shù)商業(yè)化應用的最好例證 [93]。例如， 藍十字生物藥業(yè) (北京 )有限公司生產(chǎn)的膠體金早早孕檢測試紙由人絨毛膜促性腺激素 (HCG)抗體、抗鼠 IgG、固相硝酸纖維膜和 膠體金標記的抗 HCG單克隆抗體(固相或液相 )及其它試劑組成，該試紙 可測得女性尿液中的 HCG，操作簡單、快速、結(jié)果明確 [94]。