【文章內容簡介】 外推到試樣濃度等于零時的數(shù)據(jù)。 由于顆粒的擴散系數(shù) DT 和介質的粘性系數(shù)η均與溫度密切相關，為此，為得到可靠的檢測結果，檢測應在恒溫下進行。同理，當在檢測過程中向樣品池中添加某些溶劑時，要考慮由此引起的溫度和介質粘度系數(shù)的可能變化。 透射電鏡 [5,6] 包括普通透射電鏡（ TEM）、掃描透射電鏡（ STEM）、分析電鏡（ AEM）和高分辨透射電鏡（ HREM）。以下簡單介紹透射電鏡的基本原理，著重介紹高分辨透射電鏡（ HREM）的特征。 直接觀察和研究材料的微結構對于新材料的研制和開發(fā)、材料性能的改進以及材料可靠性的評價十分重要，高分辨電子顯微方法正是一種在實空間中直接觀察材料微觀結構的實驗技術，它不僅可以獲得材料中晶胞排列的信息、還可以確定晶胞中原子的位置。對于現(xiàn)代的 200kV 級電子顯微鏡，點分辨率已高于 ，而對于 1000kV 級高壓電鏡，點分辨率已達到 。這樣高的分辨率 已能分辨幾乎所有物質晶體中原子的排列。 X 射線衍射和中子衍射的精密結構分析方法給出的是晶體的平均結構信息，而高分辨電子顯微方法可分析的體積比 X 射線結構分析的小 1014 倍，這對非均勻材料、準晶、非晶、或者空位、原子、位錯、層錯等晶體缺陷，以及晶界、相界、畸界、表面等界面的研究極為有效。 1．透 射電鏡的檢測 原理 透射電鏡中像的形成可理解為一個光學透鏡（物鏡）的成像，如圖 35 光路圖所示。具有一定波長（λ）的電子束入射到晶面間距為 d 的晶體時，在滿足布拉格條件： 2dsinθ =λ的特定角度（ 2θ）處產生衍射波，該衍射波 在物鏡的后焦面上會聚成衍射點（電子衍射花樣）。在后焦面上的衍射波繼續(xù)向前運動時，衍射波合成，在像平面上形成放大的像（電子顯微像）。通常，將生成衍射花樣的后焦面上的空間稱為倒易晶格空間，將試樣位置或成像平面稱為實空間。從試樣到后焦面的電子衍射，即是從實空間到倒易空間的變化，在數(shù)學上用傅里葉變換來表示。 71 圖 35 用光學透鏡表示電子顯微成像過程的光路圖 觀察電子顯微像時，先觀察衍射花樣，將光閘插入物鏡的后焦面，在電子衍射花樣中選擇感興趣的衍射波，調節(jié)透鏡就能得到電子顯微像。如圖 36（ a） 所示，用 物鏡光闌選擇透射波觀察時稱為明場方法 （ 得到明場像 ） ；如圖 36（ b） 所示，用物鏡光闌選擇一個衍射波觀察時稱為暗場方法（得到暗場像）。對于這兩種像，其透射波或衍射波的振幅隨區(qū)域受到不同的吸收和散射產生的襯度叫吸收衍射襯度（或振幅襯度）。 如圖 36（ c） 所示，在后焦面上插入大的物鏡光闌時，可以使兩個以上的波合成（干涉）形成像，稱為高分辨電子顯微方法，該法所使用的即是高分辨透射電鏡（ HighResolution Electron Microscope），觀察到的像稱為高分辨電子顯微像。高分辨電子顯微像的襯度是 由合成的透射波和衍射波之間的相位差形成的，稱為相位襯度。 圖 36 各種電子顯微觀察方法中物鏡光闌插入的模式 （ a） 明場方法； （ b） 暗場方法； （ c） 高分辨電子顯微方法 （ 軸向照明法 ） 72 利用不同衍射條件和試樣厚度，可以觀察到帶有各種相應信息的高分辨電子顯微像，主要有以下5 類：① 晶格條紋；② 一維結構像；③ 二維晶格像（單胞尺度的像）；④ 二維結構像（原子尺度的像，晶體結構像）；⑤ 特殊的像。 圖 37 示出了納米粒子的透射電鏡像（ 120k ）?？煽吹剑Ｗ映式魄蛐?，顆粒間粘結情況較嚴重，粒徑在 20nm~50nm 左右，為進一步研究其晶粒生長情況，對其用高分辨透射電鏡（ 1500k ）進行了觀測，如圖 38 所示。從圖 38 可觀察到多相共存的復雜像襯度和大畸變的襯度，以及不同取向的晶格條紋（其間寬即是晶面間距）和非晶態(tài)的襯度。 圖 39 提供了與圖 37 和圖 38 對應的團聚體的掃描電鏡像，請讀者參考。 圖 37 納米粒子的透射電鏡像 圖 38 納米粒子的高分辨透射電鏡像 2．樣品制備 [711] 在生物醫(yī)藥領域中應用電子透射電鏡分析技術，比在其它領域中晚，其 主要原因不是在儀器設備方面存在問題，而是在樣品制備中碰到了許多困難：① 多數(shù)生物樣品中含有大量水分，不能直接放入電鏡的真空系統(tǒng)中分析；② 生物樣品中的許多成份是以可溶性狀態(tài)存在的，如果用常規(guī)的樣品制備方法，則會導致這些可溶性成份的損失或重新分布；③ 因為生物樣品一般都不易導電和導熱，因此在對其進行分析時會引起電荷積聚和局部受熱，導致放電和熱損傷；④ 樣品在制備和分析過程中易受別的物質的污染；⑤ 透射電鏡的光源不是光束而是電子束，因為電子束的穿透能力較光束為小，不能穿透像石蠟切片那樣幾個微米厚的材料，所以必須 制備厚度在 100nm 以下的超薄切片樣品，它比石蠟切片的操作過程更為復雜細致，所有的試劑、包埋介質的要求也不相同。所有這些都會給分析造成誤差和困難，因此，電鏡分析技術中的樣品制備，是這種技術能否在醫(yī)藥科學領域中得到廣泛應 73 用的關鍵。 （ 1）常溫下的樣品制備技術 ① 無機納米顆粒、含水率低的顆粒樣品、乳液制劑： 將顆粒樣品放入與樣品不發(fā)生反應的有機溶劑（如丙酮、乙醇、丁醇等）中（一些團聚較嚴重的樣品可先在瑪瑙研缽中加少量試劑研磨一下），用超聲波分散制成均勻懸浮液，對于乳液制劑不需此步 驟。取少量上述所制懸浮液或乳液制劑滴在用碳或金增強的微柵銅網上，此微柵預先是放在濾紙上的，試劑被吸干和揮發(fā)完畢后即可進行檢測。 ② 蛋白、核酸、肽類等液滴樣品： 用微量針筒吸取 10pl~10nl 的液體樣品，置于硅玻璃片上，上面用鹽飽和的石蠟油覆蓋，以防止水分蒸發(fā)。分析時用一特制的微量移液管從上述樣品中吸取一定量（ 20pl~80pl）樣品，一個微量移液管一次可以吸取四五十個樣品，樣品之間用石蠟油分開，然后置于特別拋光的鈹片上。同樣，用鹽飽和的石蠟油覆蓋，一塊鈹片上可以放置多個樣品 。上述操作都要在解剖鏡下用微操縱器進行。待所有樣品轉移完畢，用二甲苯或氯仿除去石蠟油，立即在經液氮冷卻的異戊烷（ 160℃）中冰凍，然后在真空中冰凍干燥（ 70℃， 103Pa） 5~6 小時，干燥后的樣品在室溫下保存在放有硅膠干燥劑的真空中待分析。 ③ 其它動、植物納米藥物 主要運用濕化學法制樣技術，該技術在制樣過程中要使用各種溶液，它與常規(guī)的電鏡樣品制備技術類似，通常包括固定、洗滌、脫水、包埋固化、超薄切片等步驟。在這些過程中，樣品要與各種液體接觸，不可避免地會引起樣品中的可溶 性成分發(fā)生損失或重新分布，有的可能引入新的成份而導致樣品污染。因此，利用這種方法制樣時，要根據(jù)透射電鏡的要求，對某些步驟作適當?shù)母倪M或省略，以盡可能保持樣品中的成份不變。 固定：通常運用化學固定方法，這是目前超薄切片術中常用的一種方法，即用一定的化學試劑來固定待測樣品的結構。各種用于普通光學切片的固定液均不適于超薄切片，因這類固定液含有的酸對生物樣品結構有較大的損傷作用。電鏡技術中采用的是戊二醛 鋨酸雙固定法，即樣品先在 2~6%戊二醛中固定 2~4 小時，經緩沖液清洗后再用 1%鋨酸作后固定。除此之外，還可在戊二 醛 鋨酸中加入鞣酸作三重、四重固定。 洗滌：樣品固定前后均要用緩沖液反復沖洗，停留數(shù)小時后再多次沖洗，每次 20 分鐘以上。 脫水：用乙醇或丙酮脫水，濃度從低到高分級進行， 30% → 50% → 70% → 83% → 95% → 100%，每級 20 分鐘，最后一級（ 100%）要進行三次，每次 20 分鐘。有些樣品在脫水過程中成分損失很大，可以省去脫水步驟，直接進行包埋。 74 包埋：經過固定和脫水后的樣品，大都需要用樹脂等包埋劑浸透樣品，將其中的脫水劑置換出來，等包埋劑固化后，樣品才能切片。對包埋劑的要求是：對細胞組分的 抽提作用小；能很好地保持細胞的超微結構；在電子束照射下穩(wěn)定；對樣品產生最小的污染。常用的包埋介質是聚酯樹脂和環(huán)氧樹脂等。為使樹脂更好地滲入樣品，把脫水劑置換出來，有時在乙醇脫水之后、包埋之前使用 1,2環(huán)氧丙烷之類的過渡溶劑（用丙酮脫水時不需使用過渡溶劑），因為乙醇和樹脂互溶性不好。 切片：在電鏡中進行檢測的樣品，既要求樣品切片足夠薄，以獲得好的分辯率，有時又必須有一定的厚度，使其含有足夠量的成份，以便能獲得具有統(tǒng)計意義的成份分析結果。切片多厚為宜，與樣品中待測成份的含量有關，更重要的是取決于使用何種儀器。 有時可以連續(xù)切出厚度不同的切片，用于不同的檢測目的。切片中碰到的問題主要是樣品中成份的損失和對樣品的污染。切片時將切片漂浮在附著于刀上的液槽中，并用適當溶劑（如液體石蠟、氟里昂等，盡量不使用普通電鏡切片中使用的氯仿溶劑）使其展平，然后收集在樣品載網上。樣品刀可使用金剛石刀或玻璃刀，不能用鋼刀。 染色：其目的是增加電子圖像的反差，以便更好地觀察超微結構。常用的染色劑為醋酸氧鈾酰、檸檬酸鉛以及含有磷鎢酸、錳、鋨、釷、鉍、釩和鉻的染色劑。其干擾、污染不可避免，所以在分析時盡量不用，如果反差太小必須染色的話，則要仔 細考慮染色劑將帶來的影響。 樣品鍍膜：生物樣品一般都是熱和電的不良導體，在電子束的照射下，樣品可能局部過熱或積聚電子導致?lián)p壞。為解決這一問題，可在樣品表面鍍上一層導電的碳膜或金膜等，膜厚 5nm~10nm。 （ 2）低溫條件下的樣品制備技術 低溫條件下的樣品制備技術，主要是使生物樣品驟冷，其中的水分迅速變?yōu)楣虘B(tài)，更接近于它原來的自然狀態(tài)。低溫制樣法包括冷凍干燥、冷凍置換、冰凍超薄切片、冰凍含水樣品制備等。所用的冷凍劑有液氮（ 196℃）以及經液氮冷卻的異戊烷、氟里昂、丙烷、乙二醇等。后面這些冷卻劑比直接用液氮冷 凍效果好，因為直接用液氮冷凍，當樣品投入時，會引起液氮沸騰，在組織表面會形成一層氣泡而降低冷凍速度。 有時為獲得更低的溫度，可以使用熔融狀態(tài)的液氮漿（ liquid nitrogen slush），其溫度可低達 2160C。辦法是，將液氮置于真空中減壓蒸發(fā)，使其溫度降低到熔點附近，此時液氮變成漿糊狀，然后迅速將其從真空中取出，將樣品以最快的速度投入冷凍。為加速熱量從樣品中傳導，通常將小的樣品塊預先粘附在金屬塊上，一起投入冷凍劑。 在樣品中形成冰晶是使用冷凍技術時最常碰到的問題之一。冰晶會破壞樣品的結構，同時會 引起成份在樣品中位移。減少冰晶影響的方法之一是加快冷凍速度。冷凍速度越快，形成的冰晶越小，成份移動也越小。另一種方法是使用冷凍保護劑（ cryoprotectant），即先用冷凍保護劑如低分子量的甘油、乙二醇，高分子量的聚合物如聚乙烯基吡咯烷酮（ PVP）、羥乙基淀粉（ HES）、葡聚糖（ dextran） 75 等處理樣品，然后再進行驟冷。 冷凍后樣品的進一步的處理可以通過冷凍干燥、冰凍超薄切片、在冷凍條件下用有機溶劑置換樣品中的水分或讓水分保持在樣品中進行分析等。 冷凍干燥法：在真空條件下使冰從樣品中升華而被除去。冰升 華的速度是冰周圍蒸氣壓的函數(shù)，因此，干燥的速度取決于樣品的溫度、體積、形狀、樣品中結合水和游離水的相對數(shù)量，以及干燥器中的真空度。 一般在 60℃ ~ 110℃之間進行干燥，真空度達 102Pa 或更高，干燥時間要視樣品的體積、性質和干燥溫度而有所不同，短則幾小時，長則數(shù)天時間。樣品干燥后要逐步將其溫度升高到常溫，再進行切片或作其它處理。 另一種冷凍干燥的方法是低溫吸收法。即將冷凍過的樣品置于預先冷卻的樣品架上，封閉在一個容器中，內裝干的分子篩凝膠，然后將整個容器放入液氮中，在 70℃保持 3 天或在 60℃保持 6 天。在此過程中，干凝膠將樣品中的水分吸收，不需要真空系統(tǒng)。 上述干燥后的樣品要保持在干燥器中，以防止重新吸潮。也可以將其用樹脂包埋，再制成切片分析。 冷凍置換法：是將樣品先快速冷凍，然后用某種合適的有機溶劑，在低溫下將樣品中的水分置換出來，再用樹脂包埋、切片。 冷凍置換通常在 80℃ ~110℃進行。多種溶劑如丙酮、乙醚、乙醇、甲醇等，都可以用作置換劑。乙醚（可在其中加入 1~20%的丙烯醛）是比較理想的一種，丙酮其次，乙醇則較差。置換結束后，將樣品的溫度慢慢升高，等升到室溫后，再用樹脂包埋。固化后的樣品塊 用超薄切片機切成 m~1μ m 的片。漂浮切片的液體可以用液體石蠟或氟里昂等作為槽液，或者進行干切。 冰凍超薄切片技術：是將樣品驟冷，然后用冰凍超薄切片機進行切片，再在低溫下干燥。 用冰凍超薄切片法制備的樣品，其樣品內的成份損失很小，但是難以獲得滿意的超微結構細節(jié)。冰凍方法、樣品塊和刀的溫度、切割速度、刀的角度和鋒利程度、冰凍干燥的效率等都會影響切片的質量。 冰凍含水樣品的制備：冰凍含水樣品的制備，其冰凍、切片等操作與冰凍超薄切片差不多。樣品切片后，要用特制的工具將其轉移到裝有冷凍操作臺的電鏡中進行分析。 無論是冷凍、切片，樣品轉移或分析，都應該在盡可能低的溫度下進行操作，最好低于 130℃。 超薄切片的圖像分辨率較好，所得的圖象反差大，定量分析也較容易，但其中的水分較厚樣品中難以很好地保持。考慮到上述問題，目前多采用的樣品厚度為 1μ m ~2μ m。 冰凍含水樣品由于水分保持在樣品內，能盡可能好地保持其原始狀態(tài)。但是該法制備樣品所得到 76 的電子圖像的反差小，難以獲得較好的超微結構圖像，另外對設備要求高，操作也比較復雜，不僅要有冰凍切片機，而且要有特制的轉移樣品的裝置和分析樣品的冷凍臺。