【正文】 (CT)、篦麻毒素 (ricin)四種蛋白質(zhì)毒素的同時(shí)測(cè)定，使量子點(diǎn)探針用于實(shí)際樣品中多種毒素及其相關(guān)疾病的同時(shí)檢測(cè)成為可能。熒光共振能量轉(zhuǎn)移 也稱為非輻射能量轉(zhuǎn)移，即處于激發(fā)態(tài)的供體以偶極 偶極相互作用形式將激發(fā)能轉(zhuǎn)移給鄰近的處于基態(tài)的受體。量子點(diǎn)作為熒光共振能量轉(zhuǎn)移的供體有許多優(yōu)點(diǎn)：量子點(diǎn)具有寬的激發(fā)光譜、窄而對(duì)稱的發(fā)射光譜、大的吸收截面積，這樣就可以通過(guò)選擇合適的激發(fā)波長(zhǎng)盡可能減少對(duì)受體分子的直接激發(fā)，從而提高熒光共振能量轉(zhuǎn)移的效率。另外，由于量子點(diǎn)的發(fā)射光譜可以通過(guò)其成分及大小來(lái)調(diào)節(jié)，因而，針對(duì)不同的受體分子，通過(guò)調(diào)節(jié) 量子點(diǎn)的組成或尺寸可以使供體 (量子點(diǎn) )的發(fā)射光譜和受體 (染料 )的吸收光譜達(dá)到最大的重疊 [3739]。Mattoussi及其合作者 [41]將大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白 (MBP)通過(guò)自組裝的方式結(jié)合到量子點(diǎn)表面 ， 當(dāng) MBP的糖結(jié)合部位預(yù)先結(jié)合了猝滅劑 betacyclodextrinQSY9后，由于量子點(diǎn)與 QSY9之間存在 FRET，量子點(diǎn)的熒光就會(huì)被 猝滅 ， 當(dāng)體系中加入麥芽糖以后 ， 麥芽糖會(huì)占據(jù) MBP的糖結(jié)合位點(diǎn)， betacyclodextrinQSY9脫離 MBP，量子點(diǎn)的熒光得到恢復(fù) (見(jiàn)圖 10－ 4A)。 Clapp等人 [42]將不同熒光發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn) (510， 530，555nm)表面修飾不同量 Cy3標(biāo)記的 MBP，研究發(fā)現(xiàn)，量子點(diǎn)的發(fā)射光譜與 Cy3的吸收光譜重疊越大，量子點(diǎn)表面修飾的 Cy3標(biāo)記的 MBP越多，熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率越高。 A B 圖 10－ 4 麥芽糖結(jié)合蛋白 (MBP)功能化量子點(diǎn)用于熒光共振能量轉(zhuǎn)移 測(cè)定麥芽糖。 量子點(diǎn)用于多元光學(xué)編碼高通量分析診斷 2022年， Han等人 [44]首先提出用量子點(diǎn)進(jìn)行多元光學(xué)編碼及高通量分析診斷。從原理上講，使用六種不同顏色的量子點(diǎn)，并將每種量子點(diǎn)區(qū)分為十個(gè)強(qiáng)度，就可以實(shí)現(xiàn)一百萬(wàn)個(gè)寡聚核苷酸序列的編碼和檢測(cè)。成像及光譜測(cè)定表明這些量子點(diǎn)標(biāo)記的微珠具有高度統(tǒng)一性，并可多次 重復(fù)使用，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下生成微珠的精確度高達(dá) %。Nie課題組 [46]在研究中還發(fā)現(xiàn)，使用聚苯乙烯微球包埋量子點(diǎn)時(shí)，量子點(diǎn)僅僅進(jìn)入微球表面，很難進(jìn)入微球的內(nèi)部，他們改用多孔硅包埋量子點(diǎn)，大大提高了微球的亮度，然而多孔硅的單分散性還不太好，他們又采用多孔聚苯乙烯微球包埋量子點(diǎn) [47]，大大提高了微球的亮度及單分散性，與同樣大小的無(wú)孔聚苯乙烯微球相比，多孔聚苯乙烯微球包埋量子點(diǎn)的亮度 提高了約 1000倍。這種技術(shù)與 DNA芯片相結(jié)合，可大大簡(jiǎn)化分析過(guò)程，并提高分析的靈敏度。 量子點(diǎn)用于細(xì)胞中疾病標(biāo)志物的測(cè)定及細(xì)胞成像分析診斷 細(xì)胞是相對(duì)獨(dú)立的生物功能體，對(duì)單個(gè)活細(xì)胞的一些活動(dòng)過(guò)程進(jìn)行高效、靈敏的監(jiān)測(cè)，將有助于闡明一些重要的細(xì)胞生理過(guò)程和藥物代謝機(jī)制，有利于了解生物體的復(fù)雜性及動(dòng)力學(xué)特性。 Wu 等人 [51, 52]將免疫球蛋白 G(IgG)、鏈親和素等偶聯(lián)到量 子點(diǎn)表面，并證明了這些功能化的量子點(diǎn)探針能特異地識(shí)別亞細(xì)胞水平的分子靶點(diǎn)。同時(shí)，他們還用生物素 親和素模型檢測(cè)了細(xì)胞表面的 Her2 標(biāo)志物。為了研究量子點(diǎn)探針在醫(yī)療診斷中的可行性，他們將表達(dá) Her2的鼠乳腺腫瘤組織與兔的抗血清 (這些抗血清可以與Her2 的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域反應(yīng) )、生物素化的羊抗兔 IgG 以及鏈親和素偶聯(lián)的 QD630 一起培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)量子點(diǎn)可以特異性標(biāo)記這些腫瘤細(xì)胞。為了研究功能化量子點(diǎn)探針對(duì)細(xì)胞核靶點(diǎn)標(biāo)記的特異性，他們將固定的人類上皮細(xì)胞與人類抗核抗原(ANA)抗體、生物素化的抗人 IgG 以及鏈親和素偶聯(lián)的 QD630 一起培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)核抗原可以被鏈親和素偶聯(lián)的 QD630 特異性標(biāo)記。這些開(kāi)創(chuàng)性的研究工作，為量子點(diǎn)用于癌癥的早期診斷以及癌癥的治療奠定了基礎(chǔ)。 Lidke 等人 [50]將生物素化的 EGF 結(jié)合到中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 (CHO)的表面，在 4℃時(shí)與親和素修飾的量子點(diǎn)共培養(yǎng)，可以觀察到量子點(diǎn)也結(jié)合到了細(xì)胞表面，再將溫度升到 37℃，可觀察到細(xì)胞對(duì)量子點(diǎn)快速而廣泛的內(nèi)吞作用。這些研究結(jié)果表明：量子點(diǎn)并沒(méi)有影響 EGF的生物功能。這些研究工作證明量子點(diǎn)在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究方面具有巨大的優(yōu)越性，為未來(lái)的受體靶向治療提供了參考。 Chen等人 [53]用電穿孔的方法將偶聯(lián)細(xì)胞核定位信號(hào)多肽 (SNL)的量子點(diǎn)導(dǎo)入 Hela細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)量子點(diǎn)可以穿過(guò)細(xì)胞核孔，與靶目標(biāo)特異性結(jié)合，而偶聯(lián)任意序列多肽的量子點(diǎn)則在細(xì)胞內(nèi)部呈自由分布狀態(tài)。 量子點(diǎn)用于活體成像及疾病診斷 197。 (A， C)固定的SKBR3乳腺癌細(xì)胞與抗 Her2單克隆抗體及抗鼠 IgG標(biāo)記的量子點(diǎn)一起培養(yǎng)， Her2 被 QD535IgG(A)及 QD630IgG(C)標(biāo)記。 可以識(shí)別某些腫瘤上的腫瘤細(xì)胞及淋巴血管 )分別連接到巰基乙酸修飾的 CdSe/ZnS 核 殼型量子點(diǎn)表 面，他們首先將偶聯(lián) GFE的發(fā)綠色熒光的量子點(diǎn)注射到正常小鼠的尾部靜脈中， 5分鐘后，在激光共焦熒光顯微鏡下切片檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)合 GFE 的綠色熒光量子點(diǎn)在肺臟組織中積聚；但在其它器官 (腦，腎 )則沒(méi)有發(fā)現(xiàn)類似的積聚現(xiàn)象。然而，這些量子點(diǎn)除特異性的結(jié)合外，還能在小鼠的肝臟及脾發(fā)生非特異性聚集。這一結(jié)果預(yù)示著量子點(diǎn)可能用于疾病診斷和藥物傳遞等方面的研究 (見(jiàn)圖 10－ 6)。這種多功能量子點(diǎn)表面由兩性共聚物、腫瘤抗原識(shí)別試劑、 PEG 分子三部分組成。他們從細(xì)胞以及活體水平上研究了這種多功能的納米探針在生物體內(nèi)的分布、非特異性吸附、細(xì)胞毒性 以及藥代動(dòng)力學(xué)。當(dāng)用適當(dāng)?shù)墓饩€照射這些小鼠時(shí)，它們體內(nèi)的量子點(diǎn)便開(kāi)始發(fā)光，這種方法可指示 1000個(gè)細(xì)胞構(gòu)成的腫瘤的位置和大小。觀察這種多功能納米探針可以通過(guò)主動(dòng) (量子點(diǎn)表面抗體與腫瘤細(xì)胞表面抗原鍵合 )及被動(dòng) (量子點(diǎn)在腫瘤細(xì)胞上的滲透及保留 )兩種方式在腫瘤位置聚集。如果這一探針表面不偶聯(lián)腫瘤抗原識(shí)別試劑，而 偶聯(lián)一些用于癌癥診斷和治療的藥物試劑，如合成有機(jī)分子、寡聚核苷酸或多肽，就可以進(jìn)行早期的診斷及靶向治療。上圖表示功能化量子點(diǎn)在老鼠的特定組織上聚集的情況。 PEG 可以減少量子點(diǎn)在活體內(nèi)的非特異性吸附 [54]。 Bentzen等人 [55]成功將量子點(diǎn)用于 RSV的測(cè)定。用同樣的方法檢測(cè)了細(xì)胞表面的 G蛋白。 量子點(diǎn)光動(dòng)力療法 (PDT)治療癌癥 光動(dòng)力學(xué)腫瘤治療是世界范圍廣泛關(guān)注的重要課題。 Bakalova 等人 [56, 57]開(kāi)發(fā)出了利用量子點(diǎn)簡(jiǎn)單識(shí)別癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的技術(shù)，并通過(guò)這項(xiàng)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了將癌細(xì)胞單獨(dú)找出來(lái)進(jìn)行殺滅的方法。結(jié)果表明： antiCD 抗體偶聯(lián)量子點(diǎn)可以提高磺化鋁酞菁染料(SALPC)在 UV 照射下對(duì) 白血病 細(xì)胞的殺傷效果，這是由于 CdSe 量子點(diǎn)在光照作用下產(chǎn)生自由基，并且釋放游離 Cd2+而引起的。 量子點(diǎn)的 生物效應(yīng) 研究 量子點(diǎn)在臨床診斷、治療以及生物學(xué)領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景，但其生物安全性目前還沒(méi)有定論，在把它應(yīng)用于人體和其它生物體之前，應(yīng)該首先了解它的生物效應(yīng)。他們發(fā)現(xiàn) CdSe 量子點(diǎn)在一定的條件下會(huì)表現(xiàn)出明顯的毒性，其毒性與合成過(guò)程、表面修飾和紫外光照有關(guān)，他們認(rèn)為其細(xì)胞毒性與 CdSe晶格所釋放的 Cd2+有聯(lián)系，表面修飾物質(zhì)的不同可以不同程度的阻止 Cd2+的釋放，起到降低毒性的作用；而紫外光照將催化量子點(diǎn)表面氧 化，釋放 Cd2+。 Kirchner 等人 [60]研究了 CdSe 量子點(diǎn)及CdSe/ZnS核 殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)的細(xì)胞 毒性 ，他們用巰基丙酸、硅微球和高分子微球分別修飾量子點(diǎn)并與 細(xì)胞 混合培養(yǎng)。不同試劑修飾的量子點(diǎn)其細(xì)胞毒性也不相同。 前景與展望 由于量子點(diǎn)在細(xì)胞生物學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷及治療等方面有著廣闊的應(yīng)用前景和商業(yè)價(jià)值，很多科學(xué)家都加入到這方面的研究中來(lái)，并取得了很大的進(jìn)展?？梢灶A(yù)計(jì)，在不遠(yuǎn)的將來(lái)，多功能的量子點(diǎn)探針在腫瘤診斷和治療中將扮演重要的角色。 納米金及其在醫(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用 引言 納米金是指金的微小顆粒 (直徑 1100nm)，一般為分散在水中的水溶膠， 又稱膠體金 [62]。利用還原劑 (如：白磷、抗壞血酸、硼氫化鈉、檸檬酸鈉等 )可將氯金酸還原，制得納米金。 受相互間誘導(dǎo)偶極的影響，納米金的凝聚會(huì)引起溶液的顏色變化，且 這種變化依賴于納米金顆粒之間的距離和凝聚體的大小 [64]。本 節(jié)將從分析檢測(cè)和醫(yī)學(xué)診斷的角度對(duì)DNA功能化的納米金、蛋白質(zhì)功能化的納米金以及 糖功能化的納米金診斷試劑 進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹。以酶標(biāo)記、放射性同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記及其它探針標(biāo)記技術(shù)為基礎(chǔ)，已建立了許多有關(guān) DNA序列的檢測(cè)方法。正因?yàn)槿绱耍?Mirkin課題組 [66, 67]建立了用烷巰基化寡核苷酸探針標(biāo)記納米金并用于檢測(cè) DNA序列的新方法 ， 該法具有 以下優(yōu)點(diǎn)： (1)雜交體系的“熔點(diǎn)曲線”很陡 ， 熔解溫度的范圍很窄 ， 通過(guò)調(diào)節(jié)溫度即可辨別互補(bǔ)、錯(cuò)配、缺失、插入等各種不同情況下的 DNA靶片段，選擇性很高； (2)未優(yōu)化的體系即可檢測(cè)出 1014mol/L的 DNA靶片段 ，應(yīng)用金標(biāo) 銀染法可將信號(hào)放大 105倍 ，使 檢測(cè)的靈敏度大大提高； (3)檢測(cè)過(guò)程快速、簡(jiǎn)便，無(wú)需特殊、昂貴的儀器設(shè)備 [68]。 Mirkin 課題組 [66, 67]先將寡核苷酸探針烷巰基化、再與納米金偶聯(lián)的方法，被人們普遍采用。合成好的烷巰基化寡核苷酸探針脫去保護(hù)基團(tuán)后，用反相高效液相色譜進(jìn)行純化，再與納米金溶液按一定比例混合、孵育，并置于緩沖溶液中保持一段時(shí)間后，經(jīng)離心、洗滌等一系列后處理步驟即可在納米金顆粒表面修飾好烷巰基化寡核苷酸探針。單分散納米金和標(biāo)記有寡核苷酸探針的納米金呈紅色 。 片段的相互聯(lián)結(jié)， 納米 金會(huì)形成延伸的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) ，于是 體系的吸收峰發(fā)生紅移 ， 顏色變?yōu)樽霞t色?；谝陨瞎鈱W(xué)原理，納米金標(biāo)寡核苷酸探針 DNA雜交體系可用于 DNA靶序列的檢測(cè)。 Mirkin課題組 [69]采用三明治雜交分析法，使DNA靶序列的兩端分別與固定在基因芯片上的寡核苷酸捕獲探針和納米金標(biāo)寡核苷酸探針互補(bǔ)、雜交 ， 產(chǎn)生粉紅色斑點(diǎn) ，經(jīng) 銀染法加強(qiáng)顯色，通過(guò)目視化觀察灰度，即可定量研究DNA靶序列的雜交及單堿基錯(cuò)配的情況 (見(jiàn)圖 10－ 7)。例如， 龐代文 課題組 [65, 70]利用自制的肝炎病毒基因芯片， 目視化檢測(cè)病人血清樣本中的 HBV和 HCV基因型，該法具有靈敏度高、專一性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)迅速、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，有望用于肝炎疾病的臨床診斷。另外， 劉和平等人 [72]將 生物素化的 DNA靶序列與生物芯片上的捕獲探針雜交，利用生物素 親和素 之間特異性的作用，與親和素修飾的納米金結(jié)合后，經(jīng)銀染法目視化鑒定了大腸桿菌的 4種血清型， 該法簡(jiǎn)單、方便 ，無(wú)需 復(fù)雜的儀器， 適合于普通實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測(cè) ， 更能滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需要 ，故可 用于某些傳染病的早期診斷與監(jiān)控。例如， He等人 [73]將納米金加強(qiáng)的表面等離子體共振用于 DNA陣列分析及寡核苷酸的超靈敏檢測(cè)，其檢測(cè)限為 10pmol/L，即使不進(jìn)行優(yōu)化，該法的靈敏度也可與傳統(tǒng)的熒光法相媲美。 當(dāng)納米金表面吸附有檸檬酸根等陰離子時(shí)，受負(fù)電荷間排斥力的影響，納米金不會(huì)發(fā)生凝聚。 Li和 Rothberg[75]正是基于以上納米金 與寡核苷酸之間靜電相互作用的 原理，設(shè)計(jì)了一種 DNA分析的 新方法，該法具有以下特點(diǎn)： (1)靜電吸附，無(wú)需 共價(jià)修飾 納米金、探針或目的 DNA； (2)雜交與檢測(cè)階段分離 ； (3)目視化觀察目的產(chǎn)物的顏色變化， 簡(jiǎn)單、快速 (5min)、檢測(cè)限低 (1013mol)。 例如 ，將 DNA 靶序列固定在特定的電極上，與寡核苷酸修飾的納米金標(biāo)探針雜交，通過(guò)溶出伏安法測(cè)定溶解的金屬離子的濃度，即可檢測(cè)出 [76, 77]， Authier等人 [78]運(yùn)用該法已成功測(cè)得 人細(xì)胞 巨化病毒 (HCMV)的單鏈 DNA靶序列。而 Lin等人 [80]將納米金固定到石英晶體微天平 (QCM)上，經(jīng)寡核苷酸連接后，與溶液中的 DNA 靶序列雜交，并通過(guò) QCM 頻率的變化來(lái)監(jiān)測(cè)上述 DNA 的固定與雜交過(guò)程，研究表明，該法重現(xiàn)性好、靈敏度高，為 DNA傳感器的制作及臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。在臨床診斷中 ，單 核苷酸多態(tài)性 (SNP)可作為識(shí)別疾病基因的遺傳生物標(biāo)志 [81]。研究表明，單堿基修飾的納米金不僅能顯示 SNP的存在，還能確定突變堿基的類型 [82]。這是因?yàn)椋?(1)納米金對(duì)蛋白質(zhì)的吸附能力較強(qiáng)，使得蛋白質(zhì)的標(biāo)記過(guò)程更加簡(jiǎn)單，且標(biāo)記后的蛋白質(zhì)不易失活，同時(shí)納米金也處于更穩(wěn)定的狀態(tài)，有利于長(zhǎng)期保存；(2)通過(guò)制備不同粒徑的納米金，可進(jìn)行蛋白質(zhì)的多重標(biāo)記； (4)檢測(cè)速度快，且納米金和檢測(cè)樣本的用量都很少 [62]。隨著蛋白質(zhì)類型及 分析檢測(cè)方法的不同， 偶聯(lián)方法會(huì)有所不同，但總體來(lái)說(shuō)有兩種 。 另一種 是間接偶聯(lián)，即通過(guò)化學(xué)方法使蛋白質(zhì)分子衍生出巰基基團(tuán) [83]，再與納米金偶聯(lián)；或?qū)⒓{米金表面進(jìn)行改性 ，再用偶聯(lián)劑 (如：戊二醛 [90]、 1乙基 3[3(二甲氨基 )丙基 ]碳二亞胺 (EDC)/N羥基琥珀酰亞胺 (NHS)[91]等 )實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)與納米金的連接。 在 納米金與蛋白質(zhì)的 偶聯(lián)過(guò)程中，有以下問(wèn)題值得注意： (1)為避免蛋白質(zhì)分子失活，需選擇適當(dāng)?shù)木彌_體系，通常使用磷酸鹽緩沖溶液（ PBS）； (2)對(duì) 溫度、濃度、 pH值等偶聯(lián)條件需進(jìn)行優(yōu)化； (3)為避免或減輕蛋白質(zhì)的 非特異性吸