【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 使復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞，以期提高轉(zhuǎn)染效率。 (2) 陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合物脫離內(nèi)涵體 質(zhì)粒 DNA 通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞后，必須從內(nèi)涵體中脫離出來(lái)才能實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。否則， DNA 將隨內(nèi)涵體轉(zhuǎn)移至溶酶體內(nèi)，最終會(huì)被大量的核酸酶降解，導(dǎo)致 轉(zhuǎn)染失敗。通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞的陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合物必須與內(nèi)涵體融合，才能將DNA 釋放出來(lái)。在 DNA 從內(nèi)涵體脫離的過(guò)程中，脂質(zhì)的融合起著十分重要的作用。復(fù)合物中的 DOPE 有很好的融合性，在酸性條件下可使內(nèi)涵體膜穩(wěn)定性降低，并促進(jìn)復(fù)合物與內(nèi)涵體膜的融合。 Felgner 等 [45]研究發(fā)現(xiàn)，氯喹能大大增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)染的效果。因?yàn)槁揉且环N弱堿性物質(zhì)，在胞質(zhì)內(nèi)可以提高內(nèi)涵體的 pH，從而抑制內(nèi)涵體 溶酶體之間的融合，有助于復(fù)合物從內(nèi)涵體中脫離出來(lái)，避免了復(fù)合物被核酸酶降解。然而對(duì) DORIE/DOPE 和DMRIE/DOPE 脂質(zhì)體，氯喹的作用效果相反。這是因?yàn)橛行┲|(zhì)體與早期內(nèi)涵體發(fā)生融合，有些則與晚期內(nèi)涵體融合。氯喹能抑制早期內(nèi)涵體的成熟，阻止了晚期內(nèi)涵體的形成，從而抑制了一些脂質(zhì)體與晚期內(nèi)涵體的融合。 (3) DNA 向核周?chē)霓D(zhuǎn)運(yùn) 當(dāng)陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合物從內(nèi)涵體中脫離以后，如何將 DNA 轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核周?chē)蔀橐粋€(gè)新問(wèn)題。細(xì)胞質(zhì)是一種帶粘性的流體，微粒系統(tǒng)在其中的擴(kuò)散速率很慢，而 DNA必須轉(zhuǎn)移至核的周?chē)拍苓M(jìn)入核內(nèi)獲得表達(dá)。在胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞通過(guò)微管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)或肌動(dòng)蛋白微絲等主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)將含 DNA 的微粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至核 周?chē)?[39]。 (4) 陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合物的分解 13 研究證明， DNA 必須從陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體中分離出來(lái)，才能發(fā)揮它們的作用。將陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合物微量注射至細(xì)胞核內(nèi)，并不能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行有效轉(zhuǎn)染。另外，將裸DNA 直接注入胞漿中也不能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行有效轉(zhuǎn)染。但是，將質(zhì)粒 DNA 直接注入細(xì)胞核中卻獲得很高的基因表達(dá) [18]。這表明 DNA 必須從復(fù)合物中釋放出來(lái)，才能進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)染；而且 DNA 進(jìn)入細(xì)胞核這一過(guò)程是較為重要的限速過(guò)程。有人認(rèn)為，納米脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合物的穩(wěn)定性不同，可能會(huì)導(dǎo)致 DNA 的釋放發(fā)生在 不同的階段。 Xu 和 Szoka[40]認(rèn)為質(zhì)粒 DNA從陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合物的釋放發(fā)生于復(fù)合物與內(nèi)涵體融合的階段。復(fù)合物可使內(nèi)涵體膜穩(wěn)定性降低，引起細(xì)胞質(zhì)中內(nèi)源性陰離子脂質(zhì)的方向突變（ flipflop），擴(kuò)散進(jìn)入內(nèi)涵體后與陽(yáng)離子脂質(zhì)形成電中性的離子對(duì)，并從復(fù)合物中置換出 DNA 并使之進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。但Friend 等 [41]認(rèn)為，陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合物以一個(gè)整體從內(nèi)涵體中脫離出來(lái)，質(zhì)粒DNA 從復(fù)合物的釋放應(yīng)發(fā)生在此后的階段。此外，復(fù)合物或游離 DNA 也有可能從內(nèi)涵體上形成的小孔進(jìn)入胞質(zhì) [46]。 (5) 細(xì)胞核對(duì) DNA 的攝取 細(xì)胞核對(duì) DNA 的攝取是在基因轉(zhuǎn)染過(guò)程中最重要的一個(gè)限速步驟。 DNA 可能通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散（如核膜上的小孔）或主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入核內(nèi)。對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量大于 70000 的分子，核膜小孔將限制其進(jìn)入細(xì)胞核，通常治療采用的 DNA 相對(duì)分子質(zhì)量遠(yuǎn)大于 70000，因此 DNA主要是通過(guò)與細(xì)胞核的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)發(fā)生相互作用而進(jìn)入核內(nèi)的 [47]。對(duì)處于有絲分裂期的細(xì)胞而言，由于核膜已經(jīng)破裂，質(zhì)粒 DNA 容易進(jìn)入核內(nèi)；對(duì)于非分裂期細(xì)胞而言，核膜保持完整，質(zhì)粒 DNA 能否進(jìn)入核內(nèi)是轉(zhuǎn)染成功與否的關(guān)鍵。 Friend 等 [41]推 測(cè)納米脂質(zhì)體 DNA復(fù)合物從內(nèi)涵體中脫離出來(lái)后，脂質(zhì)與核膜融合，從而促進(jìn) DNA 進(jìn)入核內(nèi)。 納米脂質(zhì)體在基因治療中的應(yīng)用 納米脂質(zhì)體尤其是陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體可用于介導(dǎo)許多組織細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移，既可轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)細(xì)胞，也可轉(zhuǎn)染體內(nèi)組織細(xì)胞。 DCChol/DOPE 脂質(zhì)體和 DMRIE/DOPE 脂質(zhì)體在美國(guó)和英國(guó)已用于基因治療的臨床試驗(yàn)。目前陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合物的實(shí)際應(yīng)用課題主要有腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肺部和呼吸道疾病、炎癥等方面。 1 在治療腫瘤方面的應(yīng)用 陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體已廣泛用于介導(dǎo)腫瘤（包括 黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、前列腺癌等）的基因治療，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或臨床實(shí)驗(yàn)都取得了一定的效果。 14 1993 年， Nabel 等 [48]經(jīng)美國(guó) FDA 批準(zhǔn)將 HLA B7 基因用 DCChol/DOPE 陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體包埋，以基因轉(zhuǎn)染方法對(duì) 5 例缺少 HLA B7 基因的Ⅳ期惡性黑色素瘤病人進(jìn)行治療，于瘤結(jié)節(jié)內(nèi)直接注射一定劑量的納米脂質(zhì)體 基因復(fù)合物。注射后 3~7 天，用 PCR 方法在注射的瘤結(jié)節(jié)組織中可檢測(cè)到質(zhì)粒 DNA，但未在血清中檢測(cè)到。用免疫化學(xué)方法在 5 例病人瘤組織中均檢測(cè)到 HLA B7 蛋白的表達(dá)，且能檢測(cè)到機(jī)體對(duì) HLA B7 的免疫應(yīng)答。其中 1 例病人間隔治療 2 次后發(fā)現(xiàn)，注射結(jié)節(jié)及遠(yuǎn)處結(jié)節(jié)腫瘤均見(jiàn)消退，臨床實(shí)驗(yàn)取得一定成功。實(shí)驗(yàn)的可行性和安全性預(yù)示了陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體在基因治療中的潛在應(yīng)用前景。這是非病毒類(lèi)納米基因傳遞載體在人體內(nèi)的首次嘗試。 Nabel 還報(bào)道了 DMRIE/DOPE 陽(yáng)離子脂質(zhì)體的效果要好于 DCChol/DOPE 陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體。 E1A 基因可抑制裸鼠卵巢癌、乳腺癌的 HER2/neu 病毒的過(guò)度表達(dá)并誘導(dǎo)其凋亡。Hortobagyi 等人 [49]開(kāi)展了 DCChol 脂質(zhì)體 E1A 基因復(fù)合物的Ⅰ期臨床研究，將復(fù)合物 胸腔注射于 6 例乳腺癌患者。結(jié)果發(fā)現(xiàn) E1A 基因在體內(nèi)得到了一定程度的表達(dá)， HER2/neu 的過(guò)度表達(dá)和腫瘤細(xì)胞的增殖得到了抑制。該研究表明了 DCCholE1A 復(fù)合物腔內(nèi)注射給藥的有效性，同時(shí)也為 E1A 基因的Ⅱ期臨床提供了可行性保證。 Ramesh 等 [50]將陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體 DOTAP:Chol 與腫瘤抑制基因 p53 混合形成復(fù)合物，用來(lái)治療小鼠實(shí)驗(yàn)性肺癌。結(jié)果腫瘤得到了明顯抑制，且轉(zhuǎn)染效率與給藥的次數(shù)有關(guān)（多次給藥基因表達(dá)的水平為單次給藥的 倍，而且存活時(shí)間也明顯延長(zhǎng)）。 2 在治療肺部和呼吸道疾病 中的應(yīng)用 肺有一個(gè)很大的上皮表面，在陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移過(guò)程中，肺是目的基因表達(dá)水平最高的靶器官。氣管內(nèi)滴注或氣霧劑給藥可繞過(guò)內(nèi)皮屏障，使基因與呼吸道上皮細(xì)胞直接接觸，轉(zhuǎn)移給靶細(xì)胞。以肺與呼吸道為目標(biāo)的基因治療逐步引起了人們的重視。 肺囊性纖維化（ CF）是累及少數(shù)器官系統(tǒng)的常見(jiàn)常染色體隱性遺傳（ AR）綜合癥，由此引起的慢性肺病的發(fā)病率和死亡率都很高。該病致病機(jī)理是囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（ CFTR）的缺失， CFTR 是 cAMP 調(diào)節(jié)的氯離子通道。近年來(lái)，用陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體介導(dǎo)CFTR cDNA 在動(dòng)物或 人呼吸道和肺部轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)陸續(xù)開(kāi)展，大部分接受了陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體 CFTR cDNA 復(fù)合物的個(gè)體體內(nèi)都能檢測(cè)到 CFTR 基因的表達(dá)，部分恢復(fù)了氯離子通道的活力，陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體如 DOTAP/DOPE、 DCChol/DOPE 等都有成功報(bào)道 [51]。雖然 CFTR基因治療取得了一定的成功，但是有部分個(gè)體在接受治療后出現(xiàn)了炎性綜合癥，表現(xiàn)為發(fā)熱、 15 肌痛和關(guān)節(jié)痛等，血清 TNFα、 INFγ水平增加，從而抑制了基因的轉(zhuǎn)染 [52]。 3 在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用 Wareing 等 [53]通過(guò)向豚鼠耳蝸顯微注射陽(yáng)離子納米 脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合物，轉(zhuǎn)基因表達(dá)在感覺(jué)神經(jīng)上皮內(nèi)持續(xù)達(dá) 14 天，靶器官周?chē)M織沒(méi)有發(fā)生毒性和炎癥反應(yīng)。該研究是陽(yáng)離子脂質(zhì)體在耳蝸進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的首次成功嘗試，為內(nèi)耳疾患進(jìn)行基因治療提供了一種安全、快捷的方法。 局部腦缺血可導(dǎo)致缺氧性神經(jīng)細(xì)胞凋亡和壞死，缺血組織抗凋亡基因的表達(dá)可減輕局部缺血引起的損傷。大鼠局部腦缺血后，立即將構(gòu)建的人 bcl2 質(zhì)粒（ pCMVbcl2）與陽(yáng)離子脂質(zhì)體形成的復(fù)合物注射入腦脊髓液中。 48h 后， bcl2 基因得到了廣泛表達(dá)，梗死面積、梗死區(qū)域凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯減少 [54]。 4 在 防治機(jī)體炎癥損傷方面的應(yīng)用 將構(gòu)建的人 IL10 質(zhì)粒（ pcDNA3hIL10）與陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體復(fù)合后注入急性胰腺炎大鼠腹腔內(nèi)，治療 7 天后胰腺、肝和肺中人 IL10 水平顯著增加、 TNFα水平降低、組織損傷明顯減輕，且治療組大鼠存活率為 70%，而對(duì)照組僅存活 10%（ P） [55]。 在防止肺部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)方面， Zhou 等 [56]將陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體與中性粒細(xì)胞抑制因子（ NIF）基因的復(fù)合物轉(zhuǎn)入鼠體內(nèi)，研究了體內(nèi) NIF 表達(dá)對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的肺多形核中性粒細(xì)胞（ PMN）的分離及肺損傷發(fā)展的影響。結(jié)果表明， NIF 在肺血管表達(dá)產(chǎn)生一種特異的 β2整合素結(jié)合蛋白，調(diào)節(jié) PMN 通過(guò)肺泡 毛細(xì)血管上皮發(fā)生的浸潤(rùn)并阻止肺血管上皮損傷。 陽(yáng) 離子聚合物 （ cationic polymer） 陽(yáng)離子聚合物 (cationic polymer), 又稱(chēng)聚陽(yáng)離子（ polycation） ,是一類(lèi)表面帶有正電荷的高分子聚合物。 它 可以中和 DNA 質(zhì)粒表面的負(fù)電荷， 使原來(lái) DNA 螺旋結(jié)構(gòu)的龐大空間體積縮合至原有體積百分之一以下 , 加強(qiáng)了系統(tǒng)穿透能力， 聚合物將目的基因包 埋 在其中 ， 使DNA 免受核酸酶的降解 。最早用于基因傳遞的陽(yáng)離子聚合物是聚陽(yáng)離 子蛋白質(zhì)，但效率很低。近二十年來(lái)，由于合成化學(xué)和生物化學(xué)的合作與發(fā)展，出現(xiàn)了各種天然和合成的陽(yáng)離子聚合物用于基因傳遞系統(tǒng)。目前國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道大量用于基因載體的陽(yáng)離子聚合物有多肽類(lèi)：聚賴(lài)氨酸、聚谷氨酸及其衍生物；多聚胺類(lèi)：聚乙烯亞胺、聚丙烯亞胺樹(shù)狀大分子；聚甲基丙烯酸類(lèi)：聚酰胺 胺型樹(shù)狀大分子、聚甲基丙烯酸乙酯 2－（二甲胺）；陽(yáng)離子聚酯；陽(yáng)離 16 子聚磷酸酯；聚乙烯吡啶鹽；殼聚糖、明膠等（圖 74）。 聚合物分子內(nèi)存在氨基和其他活性官能團(tuán)，可通過(guò)這些活性部位對(duì)聚合物載體進(jìn)行改性。例如，可根據(jù)需要在聚合物分子上耦聯(lián)細(xì)胞 （或組織）特異靶向組分，或應(yīng)用各種修飾方式改變其生理和理化性質(zhì)。調(diào)控基因藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝、消除等處置過(guò)程 [57]。另外，可以合成相對(duì)分子質(zhì)量大小不同、結(jié)構(gòu)多樣的接枝和嵌斷共聚物，如 一個(gè)陽(yáng)離子鏈段和一個(gè)親水鏈段結(jié)合形成 的 嵌斷共聚物， 該 共聚物能自發(fā)與 DNA 形成共 聚物膠束，具有較高的膠體穩(wěn)定性 [58]。 H 2 NNNN H 2N H 2NH NN H OCH 2 OHO HN HOOCOCH 3ON H 2CH 2 OHO Hx y 支鏈 PEI 殼聚糖 NH 2N HNON H 2N HON HONNH 2N HNON HON HN H 2ON H 2N HNONH 2N HONHO NHONH2( )n PAMAM PLL 圖 74 常用的陽(yáng)離子聚合物基因載體 陽(yáng)離子聚合物載體與其它形式的非病毒 類(lèi) 載體相比有著不可比擬的優(yōu)點(diǎn) [59]： ○ 1 在生物體內(nèi)是化學(xué)惰性的但具有生物相容性 ； ○ 2 通過(guò)控制 復(fù)合物納米 粒徑尺寸和表面性質(zhì)可控制載體的生理行為 ； ○ 3 由于其特殊的結(jié)構(gòu)和表面電 荷 ，具有很高的基因轉(zhuǎn)移效率 ； ○ 4 遺傳物質(zhì)的釋放可做到由聚合物基質(zhì)的降解速率決定。 陽(yáng)離子聚合物 /DNA 納米 復(fù)合物的形成 在一定條件下，荷電相反的兩種聚電解質(zhì)相互作用能夠形成聚電解質(zhì)復(fù)合物。聚電解質(zhì)復(fù)合物中的作用力包括靜電作用、疏水作用、氫鍵和范德華力等 [60]。在反應(yīng) 中由于聚電 17 解質(zhì)分子的長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu) ， 當(dāng)反應(yīng)物分子之間某一對(duì)鏈段一旦發(fā)生復(fù)合反應(yīng)，相鄰鏈段由于不需要發(fā)生分子構(gòu)型的顯著變化，更加容易發(fā)生復(fù)合反應(yīng)。常用的 DNA 為超螺旋結(jié)構(gòu)或開(kāi)環(huán)結(jié)構(gòu)，鏈上的磷酯鍵 上 的負(fù)電荷使它成為一個(gè)鏈狀的聚 陰 離子（ PA） ,當(dāng)它與陽(yáng)離子聚合物（ PC）混合時(shí)，通過(guò)靜電作用與陽(yáng)離 子 聚合物作用形成聚電解質(zhì) 納米 復(fù)合物。該 納米 復(fù)合物電鏡下觀察顯示 [61]，多數(shù)質(zhì)粒 DNA 分子濃縮為孤立的環(huán)狀結(jié)構(gòu)， DNA 的二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，但一級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)變化，仍保留轉(zhuǎn)錄活性 。 這種聚電解質(zhì)復(fù)合物的超分子結(jié)構(gòu)可以描述為一種核 殼 結(jié)構(gòu) [62]。 在這個(gè)結(jié)構(gòu)中疏水核 是 部分中和的 DNA， 形成殼的是親水的陽(yáng)離子聚合物鏈段 ， 這種核 殼結(jié)構(gòu) ， 增大了體系在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性 ， 保護(hù) DNA 在傳遞過(guò)程不變 DNA 酶的降解。 陽(yáng)離子聚合物 /DNA 納米復(fù)合物是通過(guò)快速混合聚合物溶液和 DNA 溶液而制得。復(fù)合反應(yīng)通常只有在存在過(guò)量的陽(yáng)離子聚合物的情況下才能發(fā)生，復(fù)合的程度與陽(yáng)離子聚合物的性質(zhì)以及聚合物 /DNA 電荷比有關(guān)。 反應(yīng)體系內(nèi)的小分子電解質(zhì) 的性質(zhì)、 陽(yáng)離子聚合物 和 DNA的混合速度、聚合物濃度、溶液的離子 強(qiáng)度等因素會(huì)影響復(fù)合物的形成 [62]。 Dubruel 等 [63]認(rèn)為加料次序也會(huì)影響