【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 的耕地以糧養(yǎng)畜來(lái)解決 13億人口的吃飯問(wèn)題是行不通的。而且隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人們生活水平逐步提高，對(duì)肉、奶等畜產(chǎn)品的需求越來(lái)越多。因此，通過(guò)種草養(yǎng)畜，發(fā)展節(jié)糧型畜牧業(yè)才能盡快實(shí)行畜牧業(yè)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的合理調(diào)整，改善人民的膳食結(jié)構(gòu)，從根本上解決人畜爭(zhēng)糧的矛盾?，F(xiàn)階段我國(guó)草原畜牧業(yè)發(fā)展面臨的問(wèn)題是：第一，我國(guó)北方天然草原退化嚴(yán)重，載畜 量大幅度降低，僅靠天然草場(chǎng)已無(wú)法滿足家畜生產(chǎn)的需要。發(fā)展人工種草是解決這一發(fā)展頹勢(shì)的基本出路。第二，廣大農(nóng)區(qū)依靠秸稈養(yǎng)畜，飼養(yǎng)效率低而無(wú)法滿足質(zhì)量效益型畜牧業(yè)的發(fā)展要求，不能適應(yīng)國(guó)際化的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)。所以，種草養(yǎng)畜尤其是用優(yōu)質(zhì)牧草來(lái)飼養(yǎng)家畜對(duì)我國(guó)畜牧業(yè)發(fā)展具有重要意義 [3536]。 5 狼尾草是一種優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)牧草，它喜溫暖、濕潤(rùn)的氣候條件，對(duì)土壤要求不嚴(yán)，生性強(qiáng)健，萌發(fā)力強(qiáng)，容易栽培，對(duì)水肥要求不高，基本上無(wú)病蟲害，但在高水肥條件下，產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)可以更充分發(fā)揮。以雜交狼尾草為例，每公頃鮮草單產(chǎn) 9萬(wàn)～ 12萬(wàn) kg，在孕穗期 干物質(zhì)粗蛋白含量為 %，粗纖維 35%，無(wú)氮浸出物 %， 粗灰分 %，另含豐富的維生素和微量元素 [37]。狼尾草作為優(yōu)良的牧草品種，已被廣泛地引種利用，并培育出不少新的狼尾草品種，這些培育的品種各自具有特點(diǎn)，同時(shí)有關(guān)狼尾草被逐漸應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)上的報(bào)道也逐漸增多。 目的意義 早在 1980 年，江蘇省農(nóng)科院就從國(guó)內(nèi)外搜集作為牧草用途的狼尾草種類，共收到 7個(gè)種，近 80 份材料，其中美洲狼尾草 50 份、象草 8 份、西非狼尾草（ P. clandistum） 2份、東方狼尾草（ P. oriental） 3份、 多穗狼尾草（ P. longissimum） 6份、白草（ P. flaccidum）1 份、美洲狼尾草與象草的雜交種 10 余份 [38]。目前我國(guó)通過(guò)品種審定的狼尾草品種共有14 種 [3940]。另外，還有不少暫未登記的地方品種 [41]。狼尾草以較高生物產(chǎn)量和木質(zhì)素含量，較低的纖維素含量等優(yōu)勢(shì)，作為一種新型能源植物，受到越來(lái)越多的關(guān)注 [4243]。近年來(lái)，利用分子標(biāo)記對(duì)狼尾草屬牧草遺傳多樣性方面的研究已有報(bào)道，但僅 RAPD、 AFLP、ISSR 標(biāo)記在狼尾草屬牧草上應(yīng)用，存在檢測(cè)手段較單一和穩(wěn)定性不足的問(wèn)題 [44]。在 生產(chǎn)實(shí)踐中，豐富狼尾草屬牧草的檢測(cè)手段成為客觀需求 。 ESTSSR 是一種基于 SSR 的新型標(biāo)記，能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)出品種間的親緣關(guān)系，并且開發(fā)引物比較廉價(jià)、通用性好、條帶清楚、容易統(tǒng)計(jì)等優(yōu)點(diǎn)。如今 ESTSSR 已在植物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建及標(biāo)記輔助育種中廣泛應(yīng)用。但該技術(shù)在狼尾草屬牧草研究方面尤其是指紋圖譜構(gòu)建上還未見報(bào)道，鑒于此，本研究采用多態(tài)性豐富的 ESTSSR標(biāo)記，對(duì) 6份狼尾草屬牧草進(jìn)行 DNA指紋圖譜構(gòu)建，將對(duì)狼尾草資源的充分利用、品種鑒定與品種保護(hù)等具有重要的意義。 3 研究的內(nèi)容與方法 研究的內(nèi)容 采用 ESTSSR 分子標(biāo)記對(duì)狼尾草屬 6 個(gè)品種進(jìn)行 DNA 指紋圖譜構(gòu)建 。 技術(shù)路線 6 材料收集及種植 DNA提取 ESTSSR標(biāo)記分析 指紋圖譜構(gòu)建 材料方法 植物材料 用于 DNA指紋圖譜構(gòu)建的狼尾草屬 6種 材料，分別為紅色狼尾草、矮象草、皇竹草、桂牧 1號(hào)、寧雜 3號(hào)、臺(tái)畜 2號(hào)。 狼尾草 ESTSSR的來(lái)源和引物設(shè)計(jì) 從 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（ EST 序列，將 FASTA格式的 EST 提 交 到 網(wǎng) 上 的 “ 簡(jiǎn) 單 序 列 識(shí) 別 工 具 ” （ SSRIT ）工具（ SSR，設(shè)定識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)為重復(fù)序列的長(zhǎng)度大于 20bp。 用 “ Primer 3” 軟件（ 設(shè)計(jì) SSR 側(cè)翼區(qū)域引物。為提高引物擴(kuò)增的特異性，設(shè)定引物設(shè)計(jì)的原則為 GC 含量為 40%到 60%，最佳為 50%；退火溫度為 55℃ 到 63℃ ，最佳為 55℃ ；引物長(zhǎng)度為 18bp到 25bp，最佳為 20bp。其它參數(shù)采用默認(rèn)值，引物設(shè)計(jì)時(shí)先用中括號(hào) 將 SSR 位點(diǎn)括起來(lái)，以確保產(chǎn)物序列中包括 SSR位點(diǎn)。引物命名為 “ pems**” （ pe 是狼尾草拉丁文名第一個(gè)單詞的前兩個(gè)字母， ms 是微衛(wèi)星（ microsatellite）縮寫）。 DNA 提取及 ESTSSR PCR反應(yīng) 取生長(zhǎng)良好的狼尾草屬 6種材料幼嫩葉片，采用植物基因組 DNA提取試劑盒 DNeasy Plant Mini kit (Qigene公司，美國(guó) )提取 DNA。提取的 DNA用 %的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)進(jìn)行純度和濃度的檢測(cè)，并將樣品稀釋成 20 ng/μL后在 4℃ 下保存?zhèn)溆?。若備用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，就將 DNA樣品置于 20℃ 冰箱保存。待開始實(shí)驗(yàn)時(shí)，將各個(gè) DNA樣品取出一部分稀釋至 20ng/μL，放于 4℃ 冰箱保存并使用。 7 PCR擴(kuò)增在 BIORAD公司的 iCycler PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，具體反應(yīng)程序?yàn)椋?94℃ 預(yù)變性 5min； 94℃ 變性 1min， 52℃ 58℃ 退 火 1min， 72℃ 延伸 ，共 35個(gè)循環(huán)；最后72℃ 延伸 10min， 4℃ 保存。 電泳分析檢測(cè) ESTSS