【文章內(nèi)容簡介】 強(qiáng)度與溫度成正比，超出最適溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝和生長將會受到影響，甚至導(dǎo)致死亡。 pH 大規(guī)模培養(yǎng)時影響培養(yǎng)液的 pH穩(wěn)定性的主要因素有三種：（ 1）緩沖液的緩沖能力及種類； （ 2）對流空間大??；（ 3）葡萄糖濃度。 培養(yǎng)液中正常的緩沖系統(tǒng)是 NaHCO3/CO2系統(tǒng)，它是一種弱緩沖系統(tǒng)，其 pK為 ，低于生理學(xué)最佳要求。這種緩沖系統(tǒng)要求在培養(yǎng)液上面的對流空間加入 CO2以防止它的丟失及增加羥基離子。 也可使用磷酸緩沖液，但磷酸對動物細(xì)胞有毒害作用。 HEPES生物緩沖劑也曾被加入NaHCO3/CO2緩沖系統(tǒng)中，這是由于 HEPES的 pK為 ， HEPES被加入后，其緩沖能力為～ 。但是當(dāng) HEPES濃度高于 25mM時，它對大多數(shù)動物細(xì)胞都有毒害作用。 動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)時常有幾種方法來調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中的 pH： （ 1）在培養(yǎng)基中添加 NaHCO3作為緩沖劑及通入含 CO2的空氣進(jìn)行調(diào)節(jié) （ 2）用 行調(diào)節(jié)。由于動物細(xì)胞培養(yǎng)時要求低攪拌和弱混合，利用 NaOH或 HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)時會發(fā)生局部過酸或過堿的現(xiàn)象，從而對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，因此這種調(diào)節(jié)方法在動物細(xì)胞培養(yǎng)時不太合適。 通常通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中NaHCO3用量及通氣中 CO2濃度來控制發(fā)酵過程的 pH。 溶解氧 大規(guī)模培養(yǎng)中如何提供足夠的氧是非常重要的。通氣的目的有兩個：一是提供細(xì)胞代謝所需的足夠的氧；二是使發(fā)酵液處于均勻懸浮狀態(tài)，有利于傳質(zhì)過程。 （二）培養(yǎng)容器 多孔板、 Petri培養(yǎng)皿和組織培養(yǎng)方瓶 都是常用的靜止培養(yǎng)容器，體積小，操作方便，很容易放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 滾瓶 也是一種重要的培養(yǎng)容器，培養(yǎng)時放在滾瓶機(jī)上緩慢滾動，但培養(yǎng)條件很接近于靜止培養(yǎng)。它體積較大，接種后放入溫室或?qū)ｉT的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)依賴性貼壁培養(yǎng)細(xì)胞時，需加入微載體以增加培養(yǎng)表面積。 生物反應(yīng)器 是大規(guī)模培養(yǎng)中最重要的培養(yǎng)設(shè)備。它有各種不同形式，容積可以從 1升到幾十立方米。 微載體 微載體是指直徑在 60～ 250μm、適合于動物細(xì)胞貼附和生長的微珠。微載體法培養(yǎng)動物細(xì)胞有很多好處：①可在反應(yīng)器中提供大的比表面積②可采用均勻懸浮培養(yǎng)，簡化了各種環(huán)境因素的檢測和控制，提高了培養(yǎng)系統(tǒng)的重演性③可用普通顯微鏡觀察細(xì)胞在微載體上的生長情況④容易放大⑤適合于多種貼壁依賴性細(xì)胞培養(yǎng)⑥容易收獲細(xì)胞。 微載體培養(yǎng)系統(tǒng)的缺點(diǎn)是：①細(xì)胞生長在微載體表面，易受到剪切損傷，不適合貼壁不牢的細(xì)胞生長②微載體價格較貴，一般不能重復(fù)使用③需要較高的細(xì)胞接種量。 懸浮培養(yǎng) 懸浮培養(yǎng)指細(xì)胞在培養(yǎng)容器中自由懸浮生長的過程，主要用于非貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)，如雜交瘤細(xì)胞等。 動物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)與微生物過程比較接近，但由于動物細(xì)胞對攪拌和通氣造成的流體剪切很敏感，在反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和操作上又有特殊要求， 如利用螺旋帶葉輪減小生物反應(yīng)器培養(yǎng)過程中的剪切作用，并通過表面充氣及誘導(dǎo)表面氣泡產(chǎn)生具有雙層濾網(wǎng)的新型攪拌器，它提高了氧傳遞速率。 目前，動物細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器主要包括：轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)器、塑料袋增殖器、填充床反應(yīng)器、多層板反應(yīng)器、螺旋膜反應(yīng)器、管式螺旋反應(yīng)器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器、流化床反應(yīng)器、中空纖維及其它膜式反應(yīng)器、攪拌反應(yīng)器、氣升式反應(yīng)器等。 細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生物反應(yīng)器 氣升式生物反應(yīng)器 氣升式生物反應(yīng)器與其它反應(yīng)器相比，結(jié)構(gòu)簡單，無轉(zhuǎn)動部件，細(xì)胞損傷率低，減少了污染的機(jī)會；產(chǎn)生的湍流溫和而均勻，剪切力相當(dāng)??；直接通氣供氧，氧傳遞速率高，供氧充分；液體循環(huán)量大，細(xì)胞和營養(yǎng)成分混合均勻。 存在問題：由于液體混合的能量唯一來自通入的氣體，因而通氣量大，泡沫多，而且氣泡破碎造成嚴(yán)重的細(xì)胞機(jī)械損傷。 通氣攪拌生物反應(yīng)器 根據(jù)動物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)，要求攪拌器轉(zhuǎn)動時混合性能好，產(chǎn)生的剪切力小，氣泡產(chǎn)生的不利影響小。設(shè)計(jì)有多種形式的攪拌器，應(yīng)用最多的是籠式攪拌器。 籠式攪拌器有兩個由 200目不銹鋼絲網(wǎng)圍成的籠式腔。下部是通氣腔，上部的是消泡腔，之間有細(xì)管相通。氣體交換在通氣腔內(nèi)進(jìn)行，其中的液體通過絲網(wǎng)與腔外的液體進(jìn)行交換。在氣體鼓泡中形成的泡沫經(jīng)細(xì)管進(jìn)入消泡腔，經(jīng)絲網(wǎng)破碎分成氣液兩部分，既做到深層通氣，又避免泡沫在反應(yīng)器中積累。 攪拌器有三個導(dǎo)流筒，與攪拌器中心的垂直空腔相通，當(dāng)導(dǎo)流筒隨攪拌器轉(zhuǎn)動時，由于離心力的作用，攪拌器中心的空腔產(chǎn)生負(fù)壓，使培養(yǎng)基從底部吸入，沿空腔螺旋式上升，再從三個導(dǎo)流筒排出，繞攪拌器外緣螺旋式下降。懸浮細(xì)胞或貼附有細(xì)胞的微載體的密度接近于培養(yǎng)基，被培養(yǎng)基所裹脅，反復(fù)循環(huán)，充分混合。 在微載體法培養(yǎng)貼壁動物細(xì)胞時，一般攪拌轉(zhuǎn)速在 30～ 60r/min范圍內(nèi)。 中空纖維生物反應(yīng)器 用途較廣，既可用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，又可用于貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)。 其原理是：模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長的三維狀態(tài)，利用反應(yīng)器內(nèi)數(shù)千根中空纖維的縱向布置，提供細(xì)胞近似生理?xiàng)l件的體外生長微環(huán)境，使細(xì)胞不斷生長。中空纖維是一種細(xì)微的管狀結(jié)構(gòu)，管壁為極薄的半透膜，富含毛細(xì)管，培養(yǎng)時纖維管內(nèi)灌流充以氧氣的無血清培養(yǎng)液，管外壁則供細(xì)胞黏附生長，營養(yǎng)物質(zhì)通過半透膜從管內(nèi)滲透出來供細(xì)胞生長；對于血清等大分子營養(yǎng)物，劃必須從管外灌入，否則會被半透膜阻隔不能被細(xì)胞利用；細(xì)胞的代謝廢物也可通過半透膜滲入管內(nèi)，避免了過量代謝物對細(xì)胞的毒害作用。 優(yōu)點(diǎn) ●占地空間少； ●細(xì)胞產(chǎn)量高，細(xì)胞密度可達(dá) 109數(shù)量級； ●生產(chǎn)成本低，且細(xì)胞培養(yǎng)維持時間長，適用于長期分泌的細(xì)胞。 細(xì)胞生物反應(yīng)器的控制系統(tǒng) 由動物細(xì)胞的特性所決定，細(xì)胞培養(yǎng)不能沿用微生物發(fā)酵過程中常用的手段，安全而有效地方法是靠通入培養(yǎng)罐內(nèi)氣體中的氧氣和氮?dú)獾谋壤齺韺?shí)現(xiàn)控制溶氧值的目的； 采用二氧化碳 /碳酸氫鈉緩沖液系統(tǒng)來控制培養(yǎng)液的 pH值，它主要是靠預(yù)先加入培養(yǎng)液中適量的碳酸氫鈉和通過改變氣體流量中的二氧化碳含量來實(shí)現(xiàn)。 生物反應(yīng)器中的細(xì)胞培養(yǎng)模式 分批培養(yǎng) 分批培養(yǎng)是指將細(xì)胞和培養(yǎng)基一次性裝入反應(yīng)器內(nèi)，進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞不斷生長，產(chǎn)物也不斷形成，經(jīng)過一定時間反應(yīng)