《動(dòng)物細(xì)胞制藥》ppt課件-文庫吧
2024-12-24 04:24 本頁面
【正文】 特殊性質(zhì)或標(biāo)記的培養(yǎng)物稱為細(xì)胞株。 轉(zhuǎn)化細(xì)胞 正常細(xì)胞經(jīng)過某個(gè)轉(zhuǎn)化過程，喪失了對(duì)生長控制的敏感性。轉(zhuǎn)化伴隨著染色體模式的改變，二倍體變成異倍體。更典型的表現(xiàn)是，貼壁依賴性細(xì)胞對(duì)貼壁的依賴及細(xì)胞密度的抑制發(fā)生改變，雖然也許細(xì)胞仍需貼壁生長，但可能生長到不止單層。 細(xì)胞轉(zhuǎn)化有四種主要途徑：①有些細(xì)胞在培養(yǎng)中自發(fā)轉(zhuǎn)化。②化學(xué)轉(zhuǎn)化，某些化學(xué)致癌物會(huì)增加轉(zhuǎn)化頻率。③病毒轉(zhuǎn)化。④致瘤因子轉(zhuǎn)化。 轉(zhuǎn)化細(xì)胞由于有無限壽命，在培養(yǎng)中更易生長，被廣泛用于生產(chǎn)生物制品，如重組蛋白藥物、病毒疫苗等。但是，人們對(duì)它們的安全性仍然非常關(guān)心，對(duì)可能造成的生物危害性進(jìn)行嚴(yán)格的檢測(cè)和控制。 腫瘤細(xì)胞 腫瘤細(xì)胞是來自于腫瘤組織的細(xì)胞或經(jīng)腫瘤細(xì)胞與其它細(xì)胞融合產(chǎn)生的細(xì)胞，如雜交瘤細(xì)胞。 與轉(zhuǎn)化細(xì)胞相比，它們是惡性的，基本上是非貼壁依賴性的。腫瘤細(xì)胞有很好的增殖特性，生長速率高。對(duì)生長因子的依賴程度低，對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的要求也不那么苛刻。 體外培養(yǎng)所需的一般條件 適宜的培養(yǎng)皿、血清成分、 370C 、 CO25％、 95～ 100％濕度 、 抗生素。 腫瘤細(xì)胞的致癌性是造成其難以用于體內(nèi)治療產(chǎn)品生產(chǎn)的主要原因。由于近年來分離純化技術(shù)的進(jìn)步和對(duì)這些細(xì)胞致瘤性的深刻認(rèn)識(shí)，對(duì)其在生產(chǎn)中的應(yīng)用有所松動(dòng)，如雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)的單克隆抗體已用于體內(nèi)治療， C127細(xì)胞生成重組蛋白的研究也形成了規(guī)模。 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 培養(yǎng)基配制時(shí)考慮的因素 ?pH 多數(shù)細(xì)胞系在 。一些正常的成纖維細(xì)胞系以 ~，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系以 ~。 ?緩沖 在高細(xì)胞密度下，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系產(chǎn)生大量二氧化碳和乳酸，引起 pH下降，需要在培養(yǎng)基中加入緩沖作用的試劑，如碳酸氫鈉、 HEPES(N2羥乙基哌嗪 N’2乙磺酸 )。 溫度 低溫下 CO2溶解度增加，引起 pH變化。 黏度 培養(yǎng)基的黏度主要受血清含量的影響。在攪拌條件下黏度大則細(xì)胞受損傷小。加入羧甲基纖維素或聚乙烯基吡咯烷增加培養(yǎng)基黏度 細(xì)胞培養(yǎng)基的基本組成 （ 1）水 細(xì)胞培養(yǎng)用的各種液體都要用水來配置，對(duì)水的純度要求很高。通常細(xì)胞培養(yǎng)用水的污染物標(biāo)準(zhǔn)可參考醫(yī)藥上注射用水標(biāo)準(zhǔn)，但原則上應(yīng)高于注射用水標(biāo)準(zhǔn)。 （ 2）能源和碳源 主要是糖和糖酵解的產(chǎn)物和谷氨酰胺。細(xì)胞能用的糖主要是六碳糖，特別是葡萄糖。葡萄糖很容易被大多數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為乳酸。昆蟲細(xì)胞更偏愛蔗糖。在多數(shù)培養(yǎng)基中谷氨酰胺作為主要的能源和碳源。使用谷氨酰胺最大的問題是它的自發(fā)降解，降解量與時(shí)間、溫度、血清和磷酸濃度有關(guān)，降解產(chǎn)物為氨，對(duì)細(xì)胞有毒性。 （ 3）氮源 氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位，也是細(xì)胞合成復(fù)雜含氮化合物的前體，還作為必不可少的能源物質(zhì)。不同種類的細(xì)胞對(duì)氨基酸的種類和濃度有不同的要求，但除了谷氨酰胺外，還有 12種氨基酸不能在細(xì)胞內(nèi)合成，必須依靠從培養(yǎng)基中攝取。幾乎所有培養(yǎng)基中都含有全部必須氨基酸，根據(jù)需要補(bǔ)充適量非必需氨基酸。非必須氨基酸含量低時(shí)常會(huì)增加必須氨基酸的消耗量。增加氨基酸的濃度可以提高培養(yǎng)的細(xì)胞密度和產(chǎn)物產(chǎn)率。 （ 4）維生素 維生素是維持細(xì)胞正常生理狀態(tài)的一種重要生物活性化合物，在細(xì)胞中多形成酶的輔基或輔酶，對(duì)細(xì)胞的代謝過程有重要影響。 （ 5）無機(jī)離子 無機(jī)離子分為兩組，一種是含量較高的，包括維持膜電勢(shì)的（ Na+， K+），維持滲透壓平衡（ Na+， Cl－ ），作為酶的輔因子（ Mg2+），促進(jìn)細(xì)胞貼附（ Mg2+Ca2+），起緩沖作用（ HPO42， HCO3）；另一種勢(shì)微量元素，如鐵、錳、鋅、鉬、硒、釩、銅。 （ 6）脂類和磷脂前體 在使用血清的細(xì)胞培養(yǎng)中，脂類來自血清，在無血清培養(yǎng)中，有些細(xì)胞需要添加脂類，如膽固醇、脂肪酸、磷脂。特別是缺陷型細(xì)胞，對(duì)某種脂類有很高的依賴性。 非營養(yǎng)性物質(zhì) （ 1）抗生素 細(xì)胞培養(yǎng)中，特別是原代細(xì)胞培養(yǎng)中，常使用抗生素抑制微生物的污染。 （ 2） pH緩沖劑 最常用的緩沖劑是碳酸氫鈉，常用濃度26mmol/L，接近血中濃度，必須與 5％～ 10％CO2平衡，否則培養(yǎng)基迅速變堿。 HEPES是緩沖能力很強(qiáng)的化合物，但由于它相當(dāng)昂貴，細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中很少使用。 （ 3）酚紅 酚紅普遍作為培養(yǎng)基的 pH指示劑 （ 4）保護(hù)劑 細(xì)胞保護(hù)劑指保護(hù)細(xì)胞免受由滲透壓變化、剪切、毒性金屬和氧化劑所引起的損傷的物質(zhì)。在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的細(xì)胞會(huì)受到機(jī)械攪拌和氣泡運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的剪切損傷，某些大分子化合物，如甲基纖維素、葡聚糖、PEG、聚乙烯吡咯烷酮、 Pluronic F6血清白蛋白，能夠減輕這種損傷。 （ 5）還原劑 某些還原劑在細(xì)胞培養(yǎng)中有特殊作用。β－巰基乙醇在雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)中能刺激抗體分泌，并促進(jìn)半胱氨酸利用。 （ 6）血清 常用的血清是小牛血清、胎牛血清、馬血清和人血清。最常用的是小牛血清。 血清是極其復(fù)雜的混合物，含有食物物質(zhì)、代謝物、激素、血漿蛋白、破碎細(xì)胞釋放物質(zhì)、采血中引入的污染物。由于歷史原因，商業(yè)培養(yǎng)基大都是按添加血清來設(shè)計(jì)的，使用血清技術(shù)也很成熟，盡管使用血清有許多缺點(diǎn)，仍將其作為細(xì)胞培養(yǎng)最重要的添加劑普遍采用。 培養(yǎng)物的污染及防止 污染途徑 （ 1） 空氣：空氣流動(dòng)性大，如果培養(yǎng)操作場(chǎng)地于外界隔離不嚴(yán)格或消毒不充分，外界不潔空氣很容易進(jìn)入造成污染。因此，培養(yǎng)設(shè)施不能設(shè)在通風(fēng)場(chǎng)所。無菌操作應(yīng)在凈化臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，工作時(shí)要帶口罩 器材：各種培養(yǎng)器皿 操作：實(shí)驗(yàn)操作無菌觀念不強(qiáng)，技術(shù)不熟練，使用污染的器皿或封瓶不嚴(yán)等，都可以造成污染。 血清：有些血清在生產(chǎn)時(shí)就已經(jīng)被支原體或病毒等污染，變成了污染。 組織樣本：原代培養(yǎng)的污染多數(shù)來源于組織樣本；取材時(shí)碘酒消毒后脫碘不徹底，可造成碘混入組織，細(xì)胞或培養(yǎng)液中，影響細(xì)胞細(xì)胞生長。 動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng) （一）培養(yǎng)環(huán)境 溫度 溫度是細(xì)胞在體外生存的基本條件之一，來源不同的動(dòng)物細(xì)胞，其最適的生長溫度不同。例如昆蟲細(xì)胞的 最適溫度是 25～ 280C，人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的最適溫度是 370C，細(xì)胞代謝
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