【文章內容簡介】 （四）雙向電泳 53 隨著人類基因組計劃重點由結構基因組到功能基因組的轉移，生命科學開始進入 后基因組時代。 研究基因終產物及生命活動直接功能執(zhí)行者蛋白質的科學 蛋白質組學（ Proteomics） 應運而生。 背景知識 （四）雙向電泳 54 蛋白質組最早是由澳大利亞 Macquarie 大學的 Wilkins和 Williams在 1994年的意大利舉辦的雙向電泳會議上首次提出來的 。 背景知識 （四）雙向電泳 Proteome一詞由“蛋白質（ PROTEin）”與“基因組（ genOME）”雜合而成，對于“基因組學（ Genomics）”，“蛋白質組學”定義為一個基因組所表達的全套蛋白質。由Proteome進一步派生出 Proteomics。 55 蛋白質組學概念： 是通過大規(guī)模研究蛋白質的表達水平的變化、翻譯后修飾、蛋白質與蛋白質之間的相互作用，以獲取蛋白質水平上疾病變化、細胞進程及蛋白質網絡相互作用的整體綜合信息的科學研究。 背景知識 （四）雙向電泳 56 （四）雙向電泳 蛋白質組分析的首要要求 ? 將來自于全細胞、組織或生物體中所包含的多達幾千種混合蛋白質進行分離、檢測和分析。 ? 2DE技術依然是大多數蛋白質組研究中分離復雜蛋白質混合物的首選技術。 57 生物學問題的提出 實驗模型的設計 實驗組和對照組樣品的制備 蛋白樣品的 IEF和 PAGE電泳分離 圖像掃描和初步分析 感興趣蛋白點的切取 胰酶對脫色后蛋白質的消化 質譜的多肽指紋圖、微測序分析 質譜結果的生物信息學分析和比對 新蛋白質的發(fā)現 其它實驗的進一步驗證 蛋白信息的初步獲得 58 （四）雙向電泳 59 IPGphor IEF Unit DALT Six Unit （四）雙向電泳 60 雙向電泳法是 O′Farrall和 Klose分別在 1975年根據不同組份之間的等電點差異和分子量差異建立的。 1. 第一向等電聚焦： IEF是根據蛋白質的等電點（ pI）的不同而將他們分離的一種電泳技術。蛋白質在環(huán)境 pH 值低于 pI 時帶正電，高于 pI 值時帶負電。在加上電壓的情況下，蛋白質會向其最穩(wěn)定的狀態(tài)即等電點位置移動。 雙向電泳的基本原理 61 2. 第二向 SDSPAGE： SDS － PAGE是根據蛋白和多肽的分子量大小將其分離的。它是在含有十二烷基硫酸鈉(SDS)的聚丙烯酰胺凝膠中進行的。由于 SDS 掩蔽了蛋白本身所帶的電荷，同時形成了陰離子復合物，使單位質量的蛋白帶有大約相等的陰離子電荷。 SDS 雙向電泳的基本原理 62 等電聚焦流程圖 水化 加樣 聚焦參數設置 （四）雙向電泳 63 第二向 SDSPAGE SDSPAGE 電泳由四步驟組成： 1) 灌膠 2) 在 SDS 平衡緩沖液中平衡膠條 3) 將平衡好的膠條放置在 SDS 凝膠上 4)第二向電泳系統的準備并進行電泳 （四）雙向電泳 64 樣品制備原則 樣品制備是雙向電泳中最關鍵的一步，質量的好壞將直接影響 2DE結果。 盡管處理方法多種多樣，但都遵循幾個基本的原則： 1）盡可能的提高樣品蛋白的溶解度，抽提最大量的總蛋白，減少蛋白質的損失； 2）減少對蛋白質的人為修飾； 3）破壞蛋白質與其他生物大分子的相互作用，并使蛋白質處于完全變性狀態(tài)。 65 樣品制備需要的試劑 樣品制備需要四種主要的試劑： 1. 離液劑：主要包括尿素和硫脲； 2. 表面活性劑，也稱去垢劑：早期常使用 NPTritonX100等非離子去垢劑，近幾年較多的改用如CHAPS等雙性離子去垢劑； 3. 還原劑最常用的是二硫蘇糖醇（ DTT），也有用二硫赤蘚糖醇（ DTE）以及磷酸三丁酯（ TBP） 4. 其它：可以選擇性的加入 Trisbase,蛋白酶抑制劑（如EDTA、 PMSF 或 Protease inhibitor cocktails）以及核酸酶。 66 一般樣品處理過程 1. 細胞破碎、避免蛋白水解、樣本分級 2. 蛋白質沉淀和去除干擾物質 3. 裂解：樣本制備過程會使用高濃度尿素（或聯合使用尿素和硫脲）和一種或多種去污劑。 67 熒光差異雙向凝膠電泳技術 （ Difference gel electrophoresis , DIGE ） 68 背景知識 69 DIGE ( Difference gel electrophoresis ) 技術最早在 1997 年由 Jon Minden 實驗室的 Unlu等提出，后來 Amersham Biosciences成為此技術的主要推動者。 2022 年 Gharbis 等巧妙的將所有實驗組的樣品等量混合為內標用在每塊膠上。不久， Amersham公司便將 內標 作為 DIGE實驗設計核心原則之一 ，從而使DIGE 發(fā)展成為更加趨于成熟的體系。 背景知識 70 ? 精確： 高靈敏度確保在統計可信度范圍內能夠鑒別出可能檢測到的真實的蛋白表達最小差異。用 Ettan DIGE可以常規(guī)檢測到 10%的樣品間差異，統計可信度 95%。 ? 標準化 ： Ettan DIGE利用內標最大程度降低實驗間偏差和得到有效的數據以得出更精確的實驗結論。 ? 重復性： 極佳的定量重復性和更準確的量化蛋白表達數據 ? 高效： 多個樣品在同一塊膠上同時共分離，大大提高通量，簡化分析過程并極大減少實驗操作時間。 ? 簡化： 完整，易于使用的系統，可以完全整合到蛋白質組工作流程中。 ? 經過驗證的： 在過去 3年中， 2D DIGE技術已經在全世界超過 50家居于領導地位的研究部門使用。 Ettan DIGE相對于 傳統 2D的顯著優(yōu)勢 71 EttanTM DIGE 的組成 2DE Unit CyDye DIGE熒光標記物 DeCyder差異分析軟件 Typhoon Imager or EDI 72 1. CyDye DIGE 熒光標記物 73 1. CyDye DIGE 熒光標記物 74 ? Why we use the internal standard? 75 ? Benefits of the internal standard 76 2. 2DE Unite 77 3. Scanners 78 4. 分析軟件 79 80 圖 312 三個熒光通道圖譜以及疊加后圖譜 Figure 312 Images of three fluorescence channels and their overlay image. A: HEK293TAGPRAK cell line without stimulation, Cy3 B: HEK293TAGPRAK cell line stimulated by NaAsO2 ,Cy5, C: internal standard, Cy2 D: overlay of A and B. A B C pH3 11 81 ?傳統電泳存在的缺陷？ ? 不能克服因高電壓引起的焦耳熱！ 引發(fā)的問題： ? 分離效能低 ? 分析時間長 （五）高效毛細管電泳 82 毛細管內徑 毛細管外徑 毛細管的特點： 比表面積大 散熱快 可以用很高的電壓 分析速度加快 分離效能提高 （五）高效毛細管電泳 83 高效毛細管電泳（ Highperformance capillary electrophoresis, HPCE） ——是在一根內徑為 2575μm，長幾十厘米熔融石英玻璃 毛細管 內進行的電泳。 （五）高效毛細管電泳 是在外加電場的作用下，在毛細管中按荷電粒子 淌度或分配系數的差異 而進行分離的新技術。 84 傳統電泳 毛細管電泳 低效 電泳時間長 （幾十分鐘－幾十小時） 樣品用量大 自動化困難 高效 （柱效一般為每米幾十萬理論板數 ，凝膠電泳中能達到幾百萬甚至上千萬理論板數） 電泳時間短 （不超過 30分鐘） 樣品用量少 （進樣量為納升級） 自動化操作 （五）高效毛細管電泳 85 毛細管電泳的基本原理 恒壓下的電泳 （ 1）電泳速度 （ Electrophoretic Velocity, ν） v =L/t ν:荷電粒子電泳速度（ cm/s） 。 L:荷電粒子遷移的距離 。 t:荷電粒子遷移的時間 v =Ld/t Ld：荷電粒子通過毛細管的有效長度（毛細管進口端到檢測器的距離） 86 （ 2）淌度 （電泳遷移率， Electrophoretic mobility,μe） μe=V/E μe: 電泳遷移率，單位 ：厘米 2/伏特 秒； E:電場強度 μe=q/6πηr q:荷電粒子的靜電荷； η:溶液黏度； r:荷電粒子半徑 對于一定的荷電粒子或離子， 淌度是該粒子的特征常數 。 毛細管電泳的基本原理 87 偶電層 固體與液體接觸時，固體表面分子離解和表面吸附溶液中的離子，在 固 ——液界面 形成 相對固定和游離 的兩部分離子層，稱為 偶電層 。 在毛細管電泳中 ， 不論是帶電粒子的表面還是毛細管壁的表面都