【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 （四）雙向電泳 53 隨著人類基因組計(jì)劃重點(diǎn)由結(jié)構(gòu)基因組到功能基因組的轉(zhuǎn)移，生命科學(xué)開(kāi)始進(jìn)入 后基因組時(shí)代。 研究基因終產(chǎn)物及生命活動(dòng)直接功能執(zhí)行者蛋白質(zhì)的科學(xué) 蛋白質(zhì)組學(xué)（ Proteomics） 應(yīng)運(yùn)而生。 背景知識(shí) （四）雙向電泳 54 蛋白質(zhì)組最早是由澳大利亞 Macquarie 大學(xué)的 Wilkins和 Williams在 1994年的意大利舉辦的雙向電泳會(huì)議上首次提出來(lái)的 。 背景知識(shí) （四）雙向電泳 Proteome一詞由“蛋白質(zhì)（ PROTEin）”與“基因組（ genOME）”雜合而成，對(duì)于“基因組學(xué)（ Genomics）”，“蛋白質(zhì)組學(xué)”定義為一個(gè)基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)。由Proteome進(jìn)一步派生出 Proteomics。 55 蛋白質(zhì)組學(xué)概念： 是通過(guò)大規(guī)模研究蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的變化、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，以獲取蛋白質(zhì)水平上疾病變化、細(xì)胞進(jìn)程及蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)相互作用的整體綜合信息的科學(xué)研究。 背景知識(shí) （四）雙向電泳 56 （四）雙向電泳 蛋白質(zhì)組分析的首要要求 ? 將來(lái)自于全細(xì)胞、組織或生物體中所包含的多達(dá)幾千種混合蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、檢測(cè)和分析。 ? 2DE技術(shù)依然是大多數(shù)蛋白質(zhì)組研究中分離復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物的首選技術(shù)。 57 生物學(xué)問(wèn)題的提出 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣品的制備 蛋白樣品的 IEF和 PAGE電泳分離 圖像掃描和初步分析 感興趣蛋白點(diǎn)的切取 胰酶對(duì)脫色后蛋白質(zhì)的消化 質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測(cè)序分析 質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學(xué)分析和比對(duì) 新蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn) 其它實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證 蛋白信息的初步獲得 58 （四）雙向電泳 59 IPGphor IEF Unit DALT Six Unit （四）雙向電泳 60 雙向電泳法是 O′Farrall和 Klose分別在 1975年根據(jù)不同組份之間的等電點(diǎn)差異和分子量差異建立的。 1. 第一向等電聚焦： IEF是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（ pI）的不同而將他們分離的一種電泳技術(shù)。蛋白質(zhì)在環(huán)境 pH 值低于 pI 時(shí)帶正電，高于 pI 值時(shí)帶負(fù)電。在加上電壓的情況下，蛋白質(zhì)會(huì)向其最穩(wěn)定的狀態(tài)即等電點(diǎn)位置移動(dòng)。 雙向電泳的基本原理 61 2. 第二向 SDSPAGE： SDS － PAGE是根據(jù)蛋白和多肽的分子量大小將其分離的。它是在含有十二烷基硫酸鈉(SDS)的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行的。由于 SDS 掩蔽了蛋白本身所帶的電荷，同時(shí)形成了陰離子復(fù)合物，使單位質(zhì)量的蛋白帶有大約相等的陰離子電荷。 SDS 雙向電泳的基本原理 62 等電聚焦流程圖 水化 加樣 聚焦參數(shù)設(shè)置 （四）雙向電泳 63 第二向 SDSPAGE SDSPAGE 電泳由四步驟組成： 1) 灌膠 2) 在 SDS 平衡緩沖液中平衡膠條 3) 將平衡好的膠條放置在 SDS 凝膠上 4)第二向電泳系統(tǒng)的準(zhǔn)備并進(jìn)行電泳 （四）雙向電泳 64 樣品制備原則 樣品制備是雙向電泳中最關(guān)鍵的一步，質(zhì)量的好壞將直接影響 2DE結(jié)果。 盡管處理方法多種多樣，但都遵循幾個(gè)基本的原則： 1）盡可能的提高樣品蛋白的溶解度，抽提最大量的總蛋白，減少蛋白質(zhì)的損失； 2）減少對(duì)蛋白質(zhì)的人為修飾； 3）破壞蛋白質(zhì)與其他生物大分子的相互作用，并使蛋白質(zhì)處于完全變性狀態(tài)。 65 樣品制備需要的試劑 樣品制備需要四種主要的試劑： 1. 離液劑：主要包括尿素和硫脲； 2. 表面活性劑，也稱去垢劑：早期常使用 NPTritonX100等非離子去垢劑，近幾年較多的改用如CHAPS等雙性離子去垢劑； 3. 還原劑最常用的是二硫蘇糖醇（ DTT），也有用二硫赤蘚糖醇（ DTE）以及磷酸三丁酯（ TBP） 4. 其它：可以選擇性的加入 Trisbase,蛋白酶抑制劑（如EDTA、 PMSF 或 Protease inhibitor cocktails）以及核酸酶。 66 一般樣品處理過(guò)程 1. 細(xì)胞破碎、避免蛋白水解、樣本分級(jí) 2. 蛋白質(zhì)沉淀和去除干擾物質(zhì) 3. 裂解：樣本制備過(guò)程會(huì)使用高濃度尿素（或聯(lián)合使用尿素和硫脲）和一種或多種去污劑。 67 熒光差異雙向凝膠電泳技術(shù) （ Difference gel electrophoresis , DIGE ） 68 背景知識(shí) 69 DIGE ( Difference gel electrophoresis ) 技術(shù)最早在 1997 年由 Jon Minden 實(shí)驗(yàn)室的 Unlu等提出，后來(lái) Amersham Biosciences成為此技術(shù)的主要推動(dòng)者。 2022 年 Gharbis 等巧妙的將所有實(shí)驗(yàn)組的樣品等量混合為內(nèi)標(biāo)用在每塊膠上。不久， Amersham公司便將 內(nèi)標(biāo) 作為 DIGE實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)核心原則之一 ，從而使DIGE 發(fā)展成為更加趨于成熟的體系。 背景知識(shí) 70 ? 精確： 高靈敏度確保在統(tǒng)計(jì)可信度范圍內(nèi)能夠鑒別出可能檢測(cè)到的真實(shí)的蛋白表達(dá)最小差異。用 Ettan DIGE可以常規(guī)檢測(cè)到 10%的樣品間差異，統(tǒng)計(jì)可信度 95%。 ? 標(biāo)準(zhǔn)化 ： Ettan DIGE利用內(nèi)標(biāo)最大程度降低實(shí)驗(yàn)間偏差和得到有效的數(shù)據(jù)以得出更精確的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。 ? 重復(fù)性： 極佳的定量重復(fù)性和更準(zhǔn)確的量化蛋白表達(dá)數(shù)據(jù) ? 高效： 多個(gè)樣品在同一塊膠上同時(shí)共分離，大大提高通量，簡(jiǎn)化分析過(guò)程并極大減少實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間。 ? 簡(jiǎn)化： 完整，易于使用的系統(tǒng)，可以完全整合到蛋白質(zhì)組工作流程中。 ? 經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的： 在過(guò)去 3年中， 2D DIGE技術(shù)已經(jīng)在全世界超過(guò) 50家居于領(lǐng)導(dǎo)地位的研究部門(mén)使用。 Ettan DIGE相對(duì)于 傳統(tǒng) 2D的顯著優(yōu)勢(shì) 71 EttanTM DIGE 的組成 2DE Unit CyDye DIGE熒光標(biāo)記物 DeCyder差異分析軟件 Typhoon Imager or EDI 72 1. CyDye DIGE 熒光標(biāo)記物 73 1. CyDye DIGE 熒光標(biāo)記物 74 ? Why we use the internal standard? 75 ? Benefits of the internal standard 76 2. 2DE Unite 77 3. Scanners 78 4. 分析軟件 79 80 圖 312 三個(gè)熒光通道圖譜以及疊加后圖譜 Figure 312 Images of three fluorescence channels and their overlay image. A: HEK293TAGPRAK cell line without stimulation, Cy3 B: HEK293TAGPRAK cell line stimulated by NaAsO2 ,Cy5, C: internal standard, Cy2 D: overlay of A and B. A B C pH3 11 81 ?傳統(tǒng)電泳存在的缺陷？ ? 不能克服因高電壓引起的焦耳熱！ 引發(fā)的問(wèn)題： ? 分離效能低 ? 分析時(shí)間長(zhǎng) （五）高效毛細(xì)管電泳 82 毛細(xì)管內(nèi)徑 毛細(xì)管外徑 毛細(xì)管的特點(diǎn)： 比表面積大 散熱快 可以用很高的電壓 分析速度加快 分離效能提高 （五）高效毛細(xì)管電泳 83 高效毛細(xì)管電泳（ Highperformance capillary electrophoresis, HPCE） ——是在一根內(nèi)徑為 2575μm，長(zhǎng)幾十厘米熔融石英玻璃 毛細(xì)管 內(nèi)進(jìn)行的電泳。 （五）高效毛細(xì)管電泳 是在外加電場(chǎng)的作用下，在毛細(xì)管中按荷電粒子 淌度或分配系數(shù)的差異 而進(jìn)行分離的新技術(shù)。 84 傳統(tǒng)電泳 毛細(xì)管電泳 低效 電泳時(shí)間長(zhǎng) （幾十分鐘－幾十小時(shí)） 樣品用量大 自動(dòng)化困難 高效 （柱效一般為每米幾十萬(wàn)理論板數(shù) ，凝膠電泳中能達(dá)到幾百萬(wàn)甚至上千萬(wàn)理論板數(shù)） 電泳時(shí)間短 （不超過(guò) 30分鐘） 樣品用量少 （進(jìn)樣量為納升級(jí)） 自動(dòng)化操作 （五）高效毛細(xì)管電泳 85 毛細(xì)管電泳的基本原理 恒壓下的電泳 （ 1）電泳速度 （ Electrophoretic Velocity, ν） v =L/t ν:荷電粒子電泳速度（ cm/s） 。 L:荷電粒子遷移的距離 。 t:荷電粒子遷移的時(shí)間 v =Ld/t Ld：荷電粒子通過(guò)毛細(xì)管的有效長(zhǎng)度（毛細(xì)管進(jìn)口端到檢測(cè)器的距離） 86 （ 2）淌度 （電泳遷移率， Electrophoretic mobility,μe） μe=V/E μe: 電泳遷移率，單位 ：厘米 2/伏特 秒； E:電場(chǎng)強(qiáng)度 μe=q/6πηr q:荷電粒子的靜電荷； η:溶液黏度； r:荷電粒子半徑 對(duì)于一定的荷電粒子或離子， 淌度是該粒子的特征常數(shù) 。 毛細(xì)管電泳的基本原理 87 偶電層 固體與液體接觸時(shí)，固體表面分子離解和表面吸附溶液中的離子，在 固 ——液界面 形成 相對(duì)固定和游離 的兩部分離子層，稱為 偶電層 。 在毛細(xì)管電泳中 ， 不論是帶電粒子的表面還是毛細(xì)管壁的表面都