【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上 ,進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。由于這種方法與薩瑟恩 DNA印跡雜交技術(shù)十分類似 ,所以叫做 諾賽恩 RNA印跡技術(shù) (Northern blotting)。 而將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上 ,然后同放射性同位素 125I標(biāo)記的特定蛋白質(zhì)之抗體進(jìn)行反應(yīng) ,這種技術(shù)叫做韋斯頓蛋白質(zhì)雜交技術(shù) (Western blotting)。 斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡雜交 斑點(diǎn)印跡雜交 (dot blotting)和狹線印跡雜交 (slot blotting )是在 Southern印跡雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展的量種類式的快速檢測(cè)特定核酸(DNA和 RNA)分子的核酸雜交技術(shù)。由于在實(shí)驗(yàn)的加樣過程中使用了 特殊設(shè)計(jì)的加樣裝置 ,使眾多待測(cè)樣品能夠一次同步轉(zhuǎn)移到雜交濾膜上 ,并有規(guī)律地排列成點(diǎn)陣或線陣。這兩項(xiàng)技術(shù)更適應(yīng)與核酸樣品的定量檢測(cè)。 通過抽真空的方式將加在多孔過濾進(jìn)樣器上的核酸樣品 ,直接轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)碾s交濾膜上。 菌落雜交 也叫原位雜交 ,是指把菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上 ,使溶菌的 DNA同濾膜原位結(jié)合 ,帶有 DNA的濾膜烘干后 ,與放射性同位素標(biāo)記特異的 DNA或 RNA探針雜交。 鑒定重組子。 檢測(cè)重組體克隆的菌落雜交技術(shù) 蛋白質(zhì) /DNA、蛋白質(zhì) /RNA雜交技術(shù) 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn) (Gel retardation assay) 又叫 DNA遷移率變動(dòng)實(shí)驗(yàn) (DNA mobility shift assay),是在 80年代初期出現(xiàn)的用于在體外研究 DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。它具有簡(jiǎn)單、快捷等優(yōu)點(diǎn) ,也是當(dāng)前被選作分離純化特定 DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的一種典型的實(shí)驗(yàn)方法。 原理 : DNA與蛋白的結(jié)合導(dǎo)致了電泳時(shí)遷移率的降低。 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)的基本原理圖 放射性標(biāo)記的 DNA由于同一種細(xì)胞蛋白質(zhì) B結(jié)合，于是在凝膠電泳中移動(dòng)速度變慢，在放射自顯影中呈現(xiàn)滯后的條帶 A C B 放射自顯影 * * * * 凝膠電泳 放射性標(biāo)記的 DNA 細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物 蛋白質(zhì)與 DNA結(jié)合 * * * * * * B DNA蛋白質(zhì)結(jié)合物電泳遷移緩慢 滯后帶表明 DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合 ?不僅可以用來鑒定在特殊類型細(xì)胞的提取物中 ,是否存在與某一特定 DNA片斷結(jié)合的蛋白質(zhì)分子 ?而且可以研究發(fā)生此中結(jié)合之精確的 DNA序列的特異性。 (加入超量的非標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng) DNA) (a) (b) (c) 在凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)中競(jìng)爭(zhēng) DNA與探針 DNA之間的競(jìng)爭(zhēng)作用 （ a）沒有加入競(jìng)爭(zhēng) DNA的正常的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)，探針 DNA與特異蛋白質(zhì)結(jié)合，出現(xiàn)阻滯條帶；（ b）加入的超量競(jìng)爭(zhēng) DNA與探針 DNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合同一種蛋白質(zhì)，阻滯條帶消失；（ c）競(jìng)爭(zhēng) DNA與探針 DNA分別結(jié)合不同的蛋白質(zhì)，出現(xiàn)同（ a）一樣的阻滯條帶。 * * * * * * * * * * 蛋白質(zhì)與未標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)DNA結(jié)合 凝膠電泳 放射自顯影 蛋白質(zhì)與標(biāo)記的探針DNA結(jié)合 * * * * * * * * * * 可以間接的闡明體內(nèi)發(fā)生 DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用。 1. 用具有已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)DNA,可檢測(cè)蛋白是否屬于此類轉(zhuǎn)錄因子 2. 在競(jìng)爭(zhēng) DNA的已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)上 ,引入突變可評(píng)估突變對(duì)競(jìng)爭(zhēng) DNA性能及其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的影響。 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)?zāi)芙沂驹隗w內(nèi)發(fā)生的 DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用的有關(guān)信息 ,但無法確定兩者結(jié)合的準(zhǔn)確部位。而 DNaseⅠ 足跡實(shí)驗(yàn)可以解決這個(gè)問題 DNaseⅠ 足跡實(shí)驗(yàn) (footprinting assay) 是一類用于檢測(cè)與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列的部位及特性的專門的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。足跡實(shí)驗(yàn)的一個(gè)明顯優(yōu)點(diǎn)是 ,可以形象地展示出一種特殊的蛋白質(zhì)因子同特定 DNA片段之間的結(jié)合區(qū)域。 32p 1 5 10 ﹡ 1 4 8 10 ﹡ 加入蛋白質(zhì) X 加入 DNaseI凝膠電泳放射自顯影 1 5 10 A B 足跡 (a) (c) (b) DNaseI 足跡實(shí)驗(yàn) 如果使用較大的 DNA片段 ,通過足跡實(shí)驗(yàn)便可確定其中不同的核苷酸序列與不同蛋白質(zhì)因子之間的結(jié)合單位的分布狀況。如同凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)一樣 ,我們也可以加入非標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng) DNA序列 ,來消除特定的“足跡” ,并據(jù)此測(cè)定其核苷酸序列的特異性。 ?硫酸二甲酯 (DMS)足跡實(shí)驗(yàn) : DMS能使裸露的鳥嘌呤 (G)殘基甲基化 ,而六氫吡啶會(huì)對(duì)甲基化的 G殘基作特異的化學(xué)切割。 而與蛋白結(jié)合的 DNA片斷上的 G殘基 ,不會(huì)被 DMS甲基化 ,從而避開了六氫吡啶的切割作用。于是在 DNA片斷的序列中 ,不存在具這些 G殘基末端的 DNA片斷 ,出現(xiàn)了空白區(qū)。 甲基化干擾實(shí)驗(yàn) (methyltion interference assay) 根據(jù) DMS(硫酸二甲酯 )能夠使 G殘基甲基化 ,而六氫吡啶又能夠特異切割甲基化的 G殘基這一原理 ,設(shè)計(jì)出了另一種研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)方法 ,即甲基化干擾實(shí)驗(yàn)。這種技術(shù)可以檢測(cè)靶 DNA中特異 G殘基的優(yōu)先甲基化對(duì)而后的蛋白質(zhì)結(jié)合作用究竟會(huì)有什么效應(yīng) ,從而更加詳細(xì)地揭示DNA與蛋白質(zhì)之間相互作用的模式。 DMS化學(xué)干擾的主要局限性是 ,它只能使 G殘基甲基化。盡管如此 ,它仍不愧為足跡實(shí)驗(yàn)的一種有效的補(bǔ)充手段 ,可以鑒定足跡區(qū)段中 DNA與蛋白質(zhì)相互作用的精確位置。 具體操作如下頁(yè)圖所示。 G G G G G G m Ⅰ G G G Ⅲ m G G G m Ⅱ G G G m Ⅱ G G G m Ⅰ G G G Ⅲ m DNA 局部甲基化 與蛋白質(zhì)提取物混合 與蛋白質(zhì)結(jié)合 不與蛋白質(zhì)結(jié)合 與蛋白質(zhì)結(jié)合 凝膠電泳 與蛋白質(zhì)結(jié)合的 DNA帶含有 Ⅰ 和 Ⅲ 兩種類型 DNA片段 不能與蛋白質(zhì)結(jié)合的 DNA帶含有全部三種類型 DNA片段 切除所有結(jié)合與不結(jié)合蛋白質(zhì)的 DNA帶，并用六氫吡啶切割甲基化的 G殘基 結(jié)合帶 非結(jié)合帶 缺失的 DNA帶表明相應(yīng) G殘基的重要意義，它得到結(jié)合蛋白質(zhì)的保護(hù) 甲基化干擾實(shí)驗(yàn) 體內(nèi)足跡實(shí)驗(yàn) G G G G me G G G G Me Me 完整的細(xì)胞 裸露的 DNA DMS 硫酸二甲酯 分離 DNA并用六氫吡啶切割 凝膠分析 PCR擴(kuò)增 受保護(hù)的 G殘基 應(yīng)用甲基化保護(hù)作用進(jìn)行的體內(nèi)足跡實(shí)驗(yàn) ?DNA核苷酸序列分析 ?傳統(tǒng)的 DNA序列分析法 : Sanger雙脫氧鏈終止法和 MaxamGilbert化學(xué)分析法 ? 新發(fā)展的 DNA雜交測(cè)序法 上個(gè)世紀(jì)末 ,本世紀(jì)初， 1996年 ,清華學(xué)界對(duì)中醫(yī)氣本質(zhì)，經(jīng)絡(luò)實(shí)質(zhì)，陰陽(yáng)，五行，藏象，中醫(yī)哲學(xué)觀等都有了新的全面整體創(chuàng)造性的認(rèn)識(shí)和解說。如，鄧宇等發(fā)現(xiàn)的 :氣是流動(dòng)著的‘信息－能量－物質(zhì)’的混合統(tǒng)一體；分形分維的經(jīng)絡(luò)解剖結(jié)構(gòu)；數(shù)理陰陽(yáng)；中醫(yī)分形集：分形陰陽(yáng)集－陰陽(yáng)集的分形分維數(shù)，五行分形集－五行集的分維數(shù)；分形藏象五系統(tǒng)－暨心系統(tǒng)、肝系統(tǒng)、脾系統(tǒng)、肺系統(tǒng)、腎系統(tǒng)；中醫(yī)三個(gè)哲學(xué)觀－新提出的第三哲學(xué)觀：相似 觀－分 形論等。 還包括近代針灸經(jīng)絡(luò)的發(fā)展史 ,近代中醫(yī)氣的進(jìn)展簡(jiǎn)史 ,中西醫(yī)結(jié)合史 ,中醫(yī)中藥史等 .在明朝（ 1368年－ 1644），著名醫(yī)學(xué)家李時(shí)珍的醫(yī)學(xué)巨著 《 本草綱目 》 成書，這本書不僅是藥物學(xué)專著，還包括植物學(xué)、動(dòng)物學(xué)、（ 45傳染病 q566丙肝 964jo乙肝 28jgsx甲肝 gh）礦物學(xué)、化學(xué)等方面的知識(shí)。 《 本草綱目 》 刊行后很快傳入日本、朝鮮及越南等亞洲地區(qū)，（ df肺 25s血液 f369血小板 t5172紅血球 gdf55m白血球 fd2）在公元 1 18世紀(jì)先后被翻譯成多種歐洲語言。另一方面，李時(shí)珍是世界上第一個(gè)提出大腦負(fù)責(zé)精神感覺、又發(fā)現(xiàn)膽結(jié)石病、利用冰敷替高熱病人降溫以及發(fā)明消毒技術(shù)的醫(yī)學(xué)家。此外還有王叔和的 《 脈經(jīng) 》 、皇甫謐的 《 針灸甲乙經(jīng) 》 、陶弘景的 《 本草經(jīng)集注 》 、葛洪的 《 肘后備急方 》 、巢元方的 《 諸病源候論 》 、蘇敬的 《 新修本草 》 （ df肺 25s血液 f369血小板 t5172紅血球 gdf55m白血球 fd2）、王燾的 《 外臺(tái)秘要 》 、元丹貢布的 《 四部醫(yī)典 》 、 《 太平圣惠方 》 、王惟一的 《 銅人腧穴針灸圖經(jīng) 》 等大量醫(yī)學(xué)典籍問世。自明朝中醫(yī)發(fā)展已經(jīng)達(dá)到了頂峰，（ 45傳染病 q566丙肝 964jo乙肝 28jgsx甲肝 gh）出現(xiàn)了諸多的醫(yī)學(xué)流派。同時(shí)在朝鮮研究中醫(yī)的（ df高血壓 958心臟病 983u6糖尿病 87fr）所謂東醫(yī)學(xué)也得到了很大的發(fā)展，例如許浚撰寫了 《 東醫(yī)寶鑒 》 。 （ df4肺炎 88gdg青霉素d25f肝炎 df6） 自清朝末年，中國(guó)受西方列強(qiáng)侵略，國(guó)運(yùn)衰弱。同時(shí)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)（西醫(yī)）大量涌入，嚴(yán)重沖擊了中醫(yī)發(fā)展。中國(guó)出現(xiàn)許多人士主張醫(yī)學(xué)現(xiàn)代化，中醫(yī)學(xué)受到巨大的挑戰(zhàn)。人們開始使用西方醫(yī)學(xué)體系的思維模式加以檢視，中醫(yī)學(xué)陷入存與廢的爭(zhēng)論之中。同屬中國(guó)醫(yī)學(xué)體系的日本漢方醫(yī)學(xué)、 韓 國(guó)的韓醫(yī)學(xué)亦是如此。 2022年“非典”（ df肺 25s血液 f369血小板 t5172紅血球 gdf55m白血球 fd2）以來，經(jīng)方中醫(yī)開始有復(fù)蘇跡象。（ df高血壓 958心臟病 983u6糖尿病 87fr） 在文化大革命期間，中醫(yī)作為“古為今用”的醫(yī)學(xué)實(shí)例得到中國(guó)共產(chǎn)黨政策上的支持而得以發(fā)展?，F(xiàn)代，中醫(yī)在中國(guó)仍然是治療疾病的常用手段之一。（ 4f腫瘤 fbb癌癥 yuw3胃癌 d65i o腸癌 .f2tr肺癌 65ff） 近代、現(xiàn)代醫(yī)學(xué)史 近代的醫(yī)學(xué)（ 45傳染病 q566丙肝 964jo乙肝 28jgsx甲肝 gh） 西方近代醫(yī)學(xué)是指文藝復(fù)興以后逐漸興起的醫(yī)學(xué)，一般包括 16世紀(jì)、 17世紀(jì)、 18世紀(jì)和 19世紀(jì)的歐洲醫(yī)學(xué)。 16世紀(jì) 封建社會(huì)后期，手工業(yè)和商業(yè)發(fā)展，手工工廠出現(xiàn)，生產(chǎn)力的增長(zhǎng)也促進(jìn)對(duì)新市場(chǎng)的尋找。 1492年哥倫布發(fā)現(xiàn)新大陸 ,1497年達(dá) 伽馬發(fā)現(xiàn)好望角 ,1519～ 1522年麥哲倫環(huán)繞世界一周。（ df高血壓 958心臟病 983u6糖尿病 87fr）許多藥物（如鴉片、樟腦、松香），由東方傳入歐洲，美洲發(fā)現(xiàn)后，歐洲也有了金雞納、愈創(chuàng)木、可可果。 （ df4肺炎 88gdg青霉素 d25f肝炎 df6） 由于資本主義的興起，首先在意大利形成了資產(chǎn)階級(jí)的知識(shí)分子。他們的特點(diǎn)是敢于向教會(huì)思想挑戰(zhàn)，反對(duì)宗教迷信的束縛。他們的口號(hào)是：（ df肺 25s血液 f369血小板 t5172紅血球 gdf55m白血球 fd2） “我是人，人的一切我應(yīng)該了解”，以此來反對(duì)神學(xué)的統(tǒng)治。他們一方面?zhèn)鞑バ挛幕?,一方面竭力鉆研和模仿古代希臘的文化 ,因此此時(shí)期稱為“文藝復(fù)興”。 1543年哥白尼出版 《 天體運(yùn)行論 》 ，是科學(xué)史上文藝復(fù)興的開始。 （ 45傳染病 q566丙肝 964jo乙肝 28jgsx甲肝 gh）①醫(yī)學(xué)革命。文藝復(fù)興運(yùn)動(dòng)中，懷疑教條、反對(duì)權(quán)威之風(fēng)興起。于是，醫(yī)界也產(chǎn)生了一場(chǎng)以帕拉切爾蘇斯 (1493～ 1541) （ df高血壓 958心臟病 983u6糖尿病 87fr）為代表的醫(yī)學(xué)革命。 （ 4f腫瘤 fbb癌癥 yuw3胃癌 d65io腸癌 .f2tr肺癌 65ff） 中世紀(jì)的醫(yī)學(xué)校中 ,主要講阿維森納的 《 醫(yī)典 》 ,以及加倫和希波克拉底的著作。教師照本宣科，一切墨守成規(guī)，毫無生氣。文藝復(fù)興的狂潮，很快就波及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。帕拉切爾蘇斯指出人體的生命過程是化學(xué)過程。他在巴塞爾大學(xué)任教時(shí)主張用流行的德語寫書和講演，使醫(yī)學(xué)易為大眾所接受，這是一件偉大的改革。他重視實(shí)踐，反對(duì) 煩瑣的 經(jīng)院哲學(xué)，反對(duì)中世紀(jì)頑固的傳統(tǒng)和權(quán)威觀念，他說：“沒有科學(xué)和經(jīng)驗(yàn)，誰也不能成為醫(yī)生。（ df肺 25s血液 f369血小板 t5172紅血球 gdf55m白血球 fd2）我的著作不是引證古代權(quán)威的著作，而是靠最大的教師 ──經(jīng)驗(yàn)寫成的”