抗體工程制藥ppt課件(編輯修改稿)
2025-02-01 10:53 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 PRT，因此雜交瘤細(xì)胞可利用 H、A和 T合成 DNA而得以生長 用于細(xì)胞融和的骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)具備融和率高，自身不分泌抗體，所產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的能力強(qiáng)且長期穩(wěn)定等特點(diǎn)。 PEG的相對分子質(zhì)量和濃度越大，其促融和率越高。但其黏度和對細(xì)胞的毒性也隨之增大。常用濃度為 40%~50%，相對分子質(zhì)量 4000為佳。相對分子質(zhì)量在 400~6000，濃度在 10%~60%范圍內(nèi)的 PEG都能使細(xì)胞發(fā)生融合。為了提高融合率，在 PEG 溶液中加入 DMSO，以提高細(xì)胞接觸的緊密性，增加融合率。但必須嚴(yán)格限制接觸時(shí)間。 ? 雜交瘤細(xì)胞的篩選 —— 選擇性培養(yǎng)方法 ?將融合細(xì)胞懸浮于 HAT 培養(yǎng)液中，加入到含有飼養(yǎng)細(xì)胞（如小鼠腹腔巨噬細(xì)胞）的 96孔板內(nèi)，每 2～ 3天換液一次 ?換液時(shí)取出 1/2～ 2/3培養(yǎng)液，加入等量的新鮮培養(yǎng)液 ?細(xì)胞融合后一周內(nèi)用 HAT 培養(yǎng)液，殺死雜細(xì)胞后，第二周改用 HT 培養(yǎng)液（不含 A） ?從第三周起改用普通的 RPMI1640完全培養(yǎng)液 ?從細(xì)胞融合后 8～ 9天起可對上清進(jìn)行抗體檢測，篩選陽性克隆 ? 雜交瘤細(xì)胞的 篩選 —— 篩選陽性克隆 ?篩選要求： 微量、快速、特異、敏感、簡便，可一次性檢測大批標(biāo)本 ?常用方法： 免疫分析法，如 ELISA 將抗原固定在微孔板上，細(xì)胞培養(yǎng)上清培育一定時(shí)間后，用酶標(biāo)的抗鼠二抗，通過酶促反應(yīng)底物顏色變化，了解是否含有針對該抗原的抗體存在 。 ? 雜交瘤細(xì)胞的克隆化 ?克隆化： 使單個(gè)細(xì)胞通過無性繁殖而獲得該細(xì)胞群體的整個(gè)培養(yǎng)過程，這種群體細(xì)胞的生物學(xué)特性和功能完全相同 ?原因： 篩選出的陽性克隆中，大多數(shù)情況下產(chǎn)生抗體的雜交瘤集落不是來自單個(gè)細(xì)胞，其中可能混有不分泌抗體的細(xì)胞，這種細(xì)胞比分泌抗體的細(xì)胞生長快，容易占據(jù)優(yōu)勢；此外，剛?cè)诤系碾s交瘤細(xì)胞不穩(wěn)定，染色體易丟失 ?一般融合后的雜交瘤細(xì)胞要經(jīng)過三次左右的的克隆化，才能達(dá)到 100%孔內(nèi)均為抗體陽性細(xì)胞克隆 ? 克隆化方法 —— 有限稀釋法 ?將雜交瘤細(xì)胞懸液稀釋至一定濃度，加入到 96孔培養(yǎng)板中，使每個(gè)孔中的細(xì)胞盡可能為單細(xì)胞，經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng)最終形成細(xì)胞克隆 ?可在光學(xué)顯微鏡下觀察到細(xì)胞分裂，直至細(xì)胞集落形成 ? 克隆化方法 —— 軟瓊脂培養(yǎng)法 ?將一定濃度的待克隆細(xì)胞與 2%瓊脂糖培養(yǎng)液混合，鋪于底部含有 1%瓊脂糖培養(yǎng)液平皿的上部，待單細(xì)胞集落生長至 1～ 2 mm時(shí)，用毛細(xì)管吸取單集落，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng) ?工作效率高，一次克隆化即可獲得穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞，但對操作熟練程度要求高 ? 雜交瘤細(xì)胞庫的建立 ?第一次融合的細(xì)胞在每次克隆過程中，均應(yīng)對檢測陽性的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存一定量的細(xì)胞 ?經(jīng) 3～ 4次克隆， 100%雜交瘤細(xì)胞孔為分泌抗體陽性細(xì)胞時(shí)，擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存較大量的細(xì)胞，建立較完整的原始細(xì)胞庫 ?原始細(xì)胞庫中的細(xì)胞應(yīng)包括原始融合細(xì)胞、每次克隆的細(xì)胞及建株的細(xì)胞，且建株細(xì)胞的溯源應(yīng)明確 ?原始細(xì)胞庫中的建株細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)，再建立一個(gè)工作細(xì)胞庫，用于日常研究和生產(chǎn) ?可獲得 10181。g/ml的抗體。多采用 RPMI 1640培養(yǎng)液，添加 10%~20%胎?；蛐∨Ｑ?。但由于培養(yǎng)液中含有血清成分，總蛋白量可達(dá) 100181。g/ml以上，給純化帶來困難。加入小牛血清又是發(fā)生支原體污染的原因，而且批間質(zhì)量差異太大，直接 影響雜交瘤細(xì)胞的生長。 ?改良的方法有： 無血清 培養(yǎng)法、懸浮培養(yǎng)法、微載體 懸浮 培養(yǎng)法。 無血清培養(yǎng)法 ： 利用白蛋白、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。此法雖可減少污染，但產(chǎn)量不高。 懸浮培養(yǎng)法 ： 連續(xù)懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞密度可 2*107/ml, 收集的單克隆抗體可達(dá) 400 181。g/ml。如在培養(yǎng)液中加入微載體，細(xì)胞密度可達(dá) 108。 （ 1）體外培養(yǎng)法： ?基本程序： 接種前 1~2周，小鼠腹腔注射 Pristane（降植烷）或用液體石蠟，然后注射 1*106雜交瘤細(xì)胞， 7~12d便有腹水生成，待生成腹水后再提取，離心去細(xì)胞沉淀，取上清液凍存。 ?優(yōu)點(diǎn)： 操作簡便，比較經(jīng)濟(jì)，所得單克隆抗體量多且效價(jià)高，還可有效地保存雜交瘤細(xì)胞株和分離已污染雜菌的雜交瘤細(xì)胞株。 ?缺點(diǎn)： 小鼠腹水中混有來自小鼠的多種雜蛋白，給純化帶來難度。 （ 2）動物體內(nèi)誘生法 可獲得 10181。m/ml的抗體。常用方法。
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