【文章內(nèi)容簡介】 某些患病動(dòng)物體表有相應(yīng)的病原菌，如結(jié)核桿菌、炭疽芽孢桿菌等。 ? 消化道中的微生物： 1）非反芻動(dòng)物 ： 口腔 ：最常見的是革蘭氏陽性球菌、乳酸桿菌、棒狀桿 菌、螺旋體和真菌。 食道 ：一般不含細(xì)菌，但禽類嗉囊內(nèi)含有乳酸桿菌。 胃腸道 ：胃中主要是耐酸菌，小腸前段細(xì)菌較少，后段逐漸增多，大腸中細(xì)菌最多，常見的有大腸桿菌、腸球菌、梭菌、乳酸桿菌、擬桿菌等。哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)以乳酸桿菌最多。 2）反芻動(dòng)物 ：瘤胃中有大量的微生物，主要是厭氧性細(xì)菌。 ? 呼吸道的細(xì)菌 ：呼吸道上部，在鼻腔和鼻咽腔粘膜上有許多細(xì)菌，如葡萄球菌和一些革蘭氏陰性的球菌。呼吸道的中斷，即咽喉及扁桃體等粘膜上，常存在著潛在性致病菌，如肺炎球菌、溶血性鏈球菌等，在此部位還存在有葡萄球菌和其他革蘭氏陰性的球菌和桿菌。呼吸道下端，自氣管、支氣管到肺泡，細(xì)菌逐漸減少，支氣管末梢到肺泡內(nèi)是無菌的。 ? 泌尿生殖道的微生物 ：正常動(dòng)物機(jī)體只在泌尿生殖道外部有細(xì)菌從在，而在腎臟、輸尿管、睪丸、卵巢、子宮及輸精管、輸卵管內(nèi)一般是無菌的。 ? 雄性動(dòng)物生殖器外部有葡萄球菌和革蘭氏陽性球菌和陰性桿菌；雌性動(dòng)物外陰部有葡萄球菌、腸球菌和大腸桿菌等，一般無病原菌存在。陰道內(nèi)的細(xì)菌隨著內(nèi)分泌的變化而異，主要有乳酸桿菌、棒狀桿菌和葡萄球菌等。 第二章 微生物檢驗(yàn)技術(shù) ?【 教學(xué)要求 】 ?簡介顯微鏡的種類，講授普通光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)及使用，訓(xùn)練學(xué)生使用顯微鏡油鏡觀察微生物形態(tài)的技能 ?講授培養(yǎng)基的種類、用途及制作方法，訓(xùn)練學(xué)生制作常用培養(yǎng)基的技能 ?講授微生物的接種和培養(yǎng)方法，訓(xùn)練學(xué)生微生物培養(yǎng)基接種的技能 ?講授微生物消毒和滅菌的方法，講授熱力滅菌和化學(xué)消毒劑滅菌 ?講授無菌采樣技術(shù)，重點(diǎn)訓(xùn)練學(xué)生無菌采樣的技能 一、顯微鏡的使用及微生物制片染色 ?顯微鏡與顯微技術(shù) : 微生物制片 ? 非染色標(biāo)本的制作 ? 1）懸滴標(biāo)本的制作 ：取清潔干燥的凹玻片一張，用火柴棍挑少量凡士林涂在凹窩四周。另取清潔蓋玻片一塊，在中央滴一小滴生理鹽水或透明肉湯，再用接種環(huán)取待檢固體培養(yǎng)物少許，混于液滴中（如為液體培養(yǎng)物，可直接取于蓋玻片中央），拿起并反轉(zhuǎn)蓋玻片，使液滴向下，以其對(duì)角線垂直于凹玻片四邊的位置，輕輕壓在玻片的凹窩上，使蓋玻片與凹窩四周的凡士林粘合，封閉凹窩，即可進(jìn)行檢查。 ? 2）壓滴標(biāo)本制作 ：本法用來檢查血液、膿汁、滲出液等混濁液體檢驗(yàn)材料。取清潔載波片，滴一滴生理鹽水于其上，然后滴上待檢液體或濃稠的材料少許，混勻，蓋上蓋玻片（不能產(chǎn)生氣泡），鏡檢。 ? 染色標(biāo)本的制作 ? 細(xì)菌抹片的制作 ? 1）玻片的準(zhǔn)備 ? 2）涂片 ? （ 1）固體培養(yǎng)物涂片：先在玻片上加一滴蒸餾水，再挑取少量菌落與水混勻，涂成大小適中的薄膜。 ? （ 2）液體培養(yǎng)物涂片：先把培養(yǎng)物搖勻，再用經(jīng)火焰滅菌后的接種環(huán)挑取少量培養(yǎng)液，均勻涂在玻片上。 ? （ 3）血液抹片：在光潔玻片的一端，滴米粒大小的血液一滴，另取一邊緣光滑平整的玻片，放在血滴前方，然后稍向后拉，并向左右移動(dòng)，使血液與推片粘成一線。再以 20~30度角度均勻的用力，由一端向另一端平穩(wěn)的向前推動(dòng)，即成為較薄的、寬窄和長短適中的抹片。血片抹好后應(yīng)立即自然干燥、染色。如因故推遲染色時(shí)間，應(yīng)滴甲醇數(shù)滴于已干燥的抹片上，固定 1~2分鐘。 ? 呼吸道的細(xì)菌 ：呼吸道上部，在鼻腔和鼻咽腔粘膜上有許多細(xì)菌，如葡萄球菌和一些革蘭氏陰性的球菌。呼吸道的中斷，即咽喉及扁桃體等粘膜上，常存在著潛在性致病菌，如肺炎球菌、溶血性鏈球菌等，在此部位還存在有葡萄球菌和其他革蘭氏陰性的球菌和桿菌。呼吸道下端，自氣管、支氣管到肺泡，細(xì)菌逐漸減少，支氣管末梢到肺泡內(nèi)是無菌的。 ? 泌尿生殖道的微生物 ：正常動(dòng)物機(jī)體只在泌尿生殖道外部有細(xì)菌從在，而在腎臟、輸尿管、睪丸、卵巢、子宮及輸精管、輸卵管內(nèi)一般是無菌的。 ? 雄性動(dòng)物生殖器外部有葡萄球菌和革蘭氏陽性球菌和陰性桿菌；雌性動(dòng)物外陰部有葡萄球菌、腸球菌和大腸桿菌等，一般無病原菌存在。陰道內(nèi)的細(xì)菌隨著內(nèi)分泌的變化而異，主要有乳酸桿菌、棒狀桿菌和葡萄球菌等。 第二章 微生物檢驗(yàn)技術(shù) ?【 教學(xué)要求 】 ?簡介顯微鏡的種類，講授普通光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)及使用，訓(xùn)練學(xué)生使用顯微鏡油鏡觀察微生物形態(tài)的技能 ?講授培養(yǎng)基的種類、用途及制作方法，訓(xùn)練學(xué)生制作常用培養(yǎng)基的技能 ?講授微生物的接種和培養(yǎng)方法，訓(xùn)練學(xué)生微生物培養(yǎng)基接種的技能 ?講授微生物消毒和滅菌的方法，講授熱力滅菌和化學(xué)消毒劑滅菌 ?講授無菌采樣技術(shù)，重點(diǎn)訓(xùn)練學(xué)生無菌采樣的技能 ? （ 4）組織觸片：先用鑷子夾住組織臟器的局部通過火焰輕輕燒一下，用無菌剪刀剪取一小塊，以其切面在載玻片上輕抹或壓印成一薄層。 ? （ 5）干燥：抹片應(yīng)讓其自然干燥，急用時(shí)可在火焰近處烘干，不可直接在火中烤。 ? （ 6）固定：火焰固定、甲醇或丙酮固定。 ? (7)染色：固定后滴加染色液，以覆蓋過抹面為度，染色時(shí)間各有不同，平均為 13分鐘。 ? (8)水洗：染色時(shí)間到后，用細(xì)小的水流把多余的染料沖洗掉，被菌體吸附的染料則保留。 ? (9)干燥：標(biāo)本沖洗凈后，用吸水紙吸干或在室溫中晾干，便可鏡檢。 ? (10)鏡檢：干燥后用顯微鏡油鏡檢查。 ? 染色方法 ? 單染色法 ：用一種染色劑染色，如堿性美蘭染色法、堿性復(fù)紅染色法 ? 美蘭染色法：在已干燥固定好的抹片上，滴加幾滴美蘭染色液讓其覆蓋整個(gè)抹面，染 12分鐘，水洗、干燥、鏡檢。 ? 復(fù)染色法 ： ? 1）革蘭氏染色法 ? 2）抗酸染色法 ? 3）瑞氏染色法 ? 4）姬姆薩氏染色法 ? 5）克勒特（ Klett)氏莢膜染色法 ? 6）劉榮標(biāo)氏鞭毛染色法 ? 7）雪佛爾 — 浮爾吞（ Shefferfulton）二氏芽孢染色法 ? 1）革蘭氏染色法： ? (1)在已固定好的抹片上滴加適量的 草酸銨結(jié)晶紫 染色液，染 1~2分鐘，水洗； ? （ 2）加革蘭氏 碘液 于抹片上媒染 1~2分鐘，水洗； ? （ 3）用 95%酒精 脫色 30秒 ~1分鐘，水洗； ? （ 4）用稀釋的 石炭酸復(fù)紅液 復(fù)染 1分鐘，水洗； ? （ 5）用濾紙吸干或烘干，鏡檢。 ? 結(jié)果： G+：藍(lán)紫色； G：粉紅色 ? 注意：本染色法關(guān)鍵是酒精脫色， 如脫色過度，則陽性細(xì)菌被誤染成陰性細(xì)菌，如脫色不足，則陰性細(xì)菌被誤染成陽性細(xì)菌。脫色時(shí)間一般為 30秒左右，至藍(lán)色液體不再流出為止。 ? 2）抗酸染色法－萋 尼二氏染色法 ? 染色液的配制： ? （ 1）石炭酸復(fù)紅 ? ①堿性復(fù)紅： ? 95%酒精： 10毫升 ? ②溶解過的酚結(jié)晶： ? 蒸餾水： 95毫升 ? ①、②兩液混合即可。 ? （ 2）鹽酸酒精： ? 濃鹽酸： 3毫升 ； 95%酒精： 97毫升 ? （ 3）復(fù)染劑： ? 美藍(lán)： ； 蒸餾水： 100毫升 ?操作步驟： ?（ 1）在已經(jīng)干燥、固定的抹片上滴加石炭酸復(fù)紅染液蓋滿抹面，置玻片于酒精燈火焰上緩慢加熱，不斷擺動(dòng)玻片至發(fā)生蒸汽為止（不得讓染液沸騰干燥），經(jīng) 3分鐘后水洗； ?（ 2）用 3%鹽酸酒精脫色幾次，直至沒有顏色脫下為止，通常 2分鐘，水洗； ?（ 3）用美蘭復(fù)染 30秒 1分鐘，水洗； ?（ 4）用濾紙吸干或烘干，鏡檢。 ?結(jié)果：抗酸性細(xì)菌呈紅色，其他細(xì)菌和組織細(xì)胞呈藍(lán)色。 3）瑞氏染色法 ? 染色液的配制： ? 瑞氏染料粉： ? 純甘油： ? 中性甲醇： 60毫升 ? 儲(chǔ)于棕色瓶中，備用 ? 磷酸鹽緩沖液： ? 溶液 A：磷酸氫二鈉 ；蒸餾水： 1000ml ? 溶液 B:磷酸二氫鉀 ；蒸餾水： 1000ml ? 將溶液 A 4份與溶液 B 1份混合使用 抹片自然干燥后，滴加瑞氏染色液于抹片上，染色 13分鐘后，再加等量磷酸鹽緩沖液或中性蒸餾水，輕輕晃動(dòng)玻片混勻，染 35分鐘水洗（不能先將染液傾去，否則沉渣附在抹片上不易洗凈），吸干或烘干，鏡檢。 4）姬姆薩氏染色法 抹片經(jīng)甲醇固定干燥后，滴加姬姆薩氏染色液（在 5毫升新煮過的中性蒸餾水中滴加姬姆薩氏染色原液 510滴配制而成）或浸在有此染色液的染色缸中，經(jīng) 30分鐘至 24小時(shí)，取出水洗，吸干或烘干，鏡檢。 結(jié)果：細(xì)菌呈藍(lán)青色，組織、細(xì)胞呈其他顏色，視野呈淡紅色。 ? 5）克利特（ Klett)氏莢膜染色法 ?①美蘭： 1克； ? 95%酒精： 10毫升； ? 蒸餾水： 100毫升 ?②堿性復(fù)紅： ? 96%酒精： 1毫升 ? 蒸餾水： 99毫升 ?抹片固定好后，滴加①液在酒精燈火焰上微微加熱至生蒸汽為止，水洗。用②液復(fù)染 15秒，水洗，吸干，鏡檢。菌體呈藍(lán)色，莢膜呈紅色。 ? 6）劉榮標(biāo)氏鞭毛染色法 ?溶液 A： 5%石炭酸： 10毫升 ? 鞣酸粉末： 2克 ? 飽和鉀樊溶液： 10毫升 ?溶液 B： 12%結(jié)晶紫飽和酒精溶液 ?染色時(shí)，將 A液 10份加 B液 1份。混合液能在冰箱保存 7個(gè)月以上。 ?染色：取經(jīng)過多次移植活化的幼年培養(yǎng)物（ 24小時(shí)之內(nèi)）做成抹片，干燥后滴加混合染色液在室溫下染 23分鐘，水洗，吸干，鏡檢，菌體和鞭毛均染成紫色。 ? 7）雪佛爾 — 浮爾吞（ Shefferfulton）二氏芽孢染色法 ?染色液：①孔雀綠： 5克 ? 蒸餾水： 100毫升 ? ② 沙黃： ? 蒸餾水： 100毫升 ?染色：制備好的細(xì)菌抹片干燥和固定后，加 5%孔雀綠水溶液在其上，加熱 3060秒，使發(fā)生蒸汽 34次。水洗，用 %沙黃水溶液復(fù)染 30秒。水洗，吸干，鏡檢。菌體呈紅色，芽孢呈綠色。 二、微生物的培養(yǎng)基 ? 培養(yǎng)基的概念 ： 在實(shí)驗(yàn)室中配制的適合微生物生長繁殖或累積代謝產(chǎn)物的任何營養(yǎng)基質(zhì)，都叫做培養(yǎng)基 (Media)。 ? 一、培養(yǎng)基配制的基本原則 ： ? 明確配制培養(yǎng)基的目的 ? 符合微生物菌種的營養(yǎng)特點(diǎn) ? 控制營養(yǎng)物質(zhì)的比例及其濃度 ? 控制 PH值 ? 控制氧化還原電位 ? 控制營養(yǎng)物質(zhì)來源 ? 選擇適宜的滅菌處理方法 ?二、培養(yǎng)基的類型及應(yīng)用 ?根據(jù)營養(yǎng)成分的來源分類 ：天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基 (在生產(chǎn)實(shí)踐和實(shí)驗(yàn)室中使用最多 )。 ?根據(jù)物理狀態(tài)分類 ：液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基 ?根據(jù)用途分類 ： ? 實(shí)驗(yàn)室用培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基（增菌培養(yǎng)基）、鑒別培養(yǎng)基 (例如用以檢查飲水和乳品中是否含有腸道致病菌的伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基就是一種常用的鑒別性培養(yǎng)基 ) 、選擇培養(yǎng)基 ? 生產(chǎn)用培養(yǎng)基：孢子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基 ? 三、培養(yǎng)基的配制過程 ： ? 配制前的準(zhǔn)備 在制備培養(yǎng)基的過程中，要使用一些玻璃器皿，如試管、三角瓶、培養(yǎng)皿、燒杯和吸管等。這些器皿在使用前都要根據(jù)不同的情況，經(jīng)過一定的處理，洗刷干凈。有的還要進(jìn)行包裝，經(jīng)過滅菌等準(zhǔn)備就緒后，才能使用。 ? 配制方法的選擇 1）實(shí)驗(yàn)室用培養(yǎng)基的配制方法： 營養(yǎng)物質(zhì)溶解 → PH的調(diào)整 → 過濾 → 滅菌 → 分裝 2）生產(chǎn)用培養(yǎng)基的配制方法： 除雜 → 原料粉碎 → 熱處理 ? 配制操作 配制結(jié)果的驗(yàn)證 ?每批培養(yǎng)基制備好以后，應(yīng)仔細(xì)檢查一遍，如發(fā)現(xiàn)破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞被培養(yǎng)基沾染等、均應(yīng)挑出棄去。并測定其最終 pH。 ?將全部培養(yǎng)基放入 36177。 1℃ 恒溫箱培養(yǎng)過夜，如發(fā)現(xiàn)有菌生長，即棄去。 ?用有關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)菌株接種 1~2管 (瓶 )培養(yǎng)基，培養(yǎng) 24~48小時(shí)，如無菌生長或生長不好。應(yīng)追查原因并重復(fù)接種一次，如結(jié)果仍同前，則該批培養(yǎng)基即應(yīng)棄去，不能使用。 ?無菌接種 接種前準(zhǔn)備： ?注意無菌室的日常清潔衛(wèi)生，并經(jīng)常進(jìn)行消毒滅菌工作 ?在接種前應(yīng)先打開紫外燈滅菌半小時(shí) ?進(jìn)行無菌室無菌程度檢查，全部檢查合格后方可應(yīng)用 ?準(zhǔn)備無菌工作鞋、工作衣、口罩等 ?無菌操作所涉及到的器皿均嚴(yán)格消毒 ?接種用的平皿、試管、三角燒瓶等做好標(biāo)記，注明培養(yǎng)基、菌種名稱及日期 ? 接種時(shí)操作要點(diǎn)： ? 雙手用醫(yī)用酒精或新潔爾滅擦拭 ? 操作過程不應(yīng)離開酒精燈火焰 ? 棉塞不得隨意亂放 ? 接種前接種工具需經(jīng)火焰燒灼滅菌 ? 接種時(shí)動(dòng)作要規(guī)范、科學(xué)，應(yīng)盡量減少操作步驟，迅速接種 ? 接種結(jié)束