實用組織化學技術(shù)-常規(guī)病理組織學和組織化學(研究生)(編輯修改稿)
2025-01-31 09:47 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 鏡超薄切片的小組織塊 標本的初 固定 。 組織固定方法 1. 原位固定法 在活體情況下，采用快速邊取材邊滴加固定液，取出標本后再浸泡固定 30min1h，以上操作應在 04℃ 下進行。 2. 浸透固定法 固定液 04℃ ，量應是樣品 40倍以上，浸泡 3090min或更長。 3. 培養(yǎng)細胞和涂片固定法 單層細胞培養(yǎng)瓶只需將培養(yǎng)內(nèi)蓋片取出浸透固定即可。懸液培養(yǎng)細胞應離心濃縮后涂片，或離心管內(nèi)加入固定液 2022r/min約 20 min離心成團后制作切片。 也可以向離心管內(nèi)加入膠凍再離心，切取離心管尖端膠凍固定。 4. 灌注固定法 通過心血管途徑將固定劑灌注到全身或某一器官，使生活的細胞在原位迅速固定后再取材，可達到非常好的固定效果，尤其對于腦等需要很長取材時間的器官更有意義。 麻醉 或 頸椎脫臼 處死動物后，立即打開胸腹腔和心包，滴溜注射針刺入左心室或主動脈內(nèi)，剪開右心耳排血，立即用含有適量肝素的生理鹽水或緩沖液灌注，清洗血液；然后很快用固定液繼續(xù)灌注，大小鼠心灌注時其壓力約為 100150mmHg，灌流量約為 510ml/min，灌注時間一般在 520min左右，一般以觀察動物肝質(zhì)地變硬為準。 灌注固定完成后取材，并用固定液后固定 2小時。 灌注固定快速均勻， 可保存細胞組織的微細結(jié)構(gòu)。 三、水洗 用水道流水洗滌，目的是將組織塊中的固定液取代出來，水洗一定要充分。 水洗時間數(shù)小時至 24小時。 根據(jù)材料多少、大小可靈活掌握水洗工具，可用水洗筐或用紗布包裹，要防止水流大將組織塊沖掉或丟失。 科研用小材料 也可用 PBS液多次浸泡洗滌 ，但要保證 至少 46小時的洗滌時間 。 四、脫水 組織塊固定后雖然已經(jīng)硬化，但達不到切薄片的硬度，必須進行除固定液以外的其它處理，脫水就是繼固定后的重要步驟。 經(jīng)固定和水洗后的組織含大量水份，在這種情況下首先必須除去組織內(nèi)部的水份，這種除水的過程叫做 脫水 ，脫水使用的藥劑稱為 脫水劑 。 脫水必須逐漸依次從低濃度酒精開始到高濃度酒精，否則會引起組織強烈收縮變脆，不利制片，但脫水不徹底也很難浸蠟。 常用脫水劑：酒精、丙酮、正丁醇等。 1. 酒精 一股是從 70％酒精開始，經(jīng) 80％ — 90％ — 95％ — 100％ I一 100II％，每步驟脫水時間根據(jù)材料大小而靈活掌握，一般數(shù)小時到 12小時，更換一次酒精。 無水乙醇不適合用來配低濃度酒精，價格較貴。取 95％酒精 70ml加蒸餾水 25ml，配成 70％酒精 95ml。 80％酒精取 95％酒精 80ml加蒸餾水至 95ml即可，依次類推。 2. 丙酮 脫水作用與酒精相似，雖然其脫水作用比酒精強，但對組織塊的收縮較嚴重，且價錢較貴，故不宜用于一股組織脫水。丙酮既有脫水作用，又有透明作用。 用丙酮固定的材料要小，脫水 1一 8小時即可。 五、透明 組織塊脫水后需要透明，因為水與蠟不能相交換，需要借助石蠟誘導劑的過渡。石蠟誘導劑滲入之后組織塊往往呈現(xiàn)透明狀態(tài)，習慣上將石蠟誘導劑滲入組織內(nèi)的過程叫透明，而這種藥劑稱為 透明劑 。 透明的時間依組織塊的大小而定，一般采用 20分鐘至 1小時左右，如組織塊過大可延長透明時間，透明好的材料如同油炸的感覺，呈透明狀。 最常用的透明劑為 二甲苯、氯仿、甲苯、香柏油 等。 二甲苯 ：是無色透明的一種有機溶媒，有很強的刺激氣味，易揮發(fā)，長期接觸對粘膜有刺激作用。 二甲苯透明組織的作用很強，可使組織收縮變形，故透明時間不宜過長。 透明過程中如遇到組織塊內(nèi)部或某一個部位呈白色混濁狀態(tài)時，說明脫水不徹底，進而造成透明不徹底，無法下一步浸蠟。應退回到 100％酒精中重新徹底脫水。 六、浸蠟與包理 浸蠟的目的 是為了能制備一菲薄的切片做準備。
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