醫(yī)學(xué)]atp生物熒光腫瘤體外藥敏檢測技術(shù)atp-tca的建立(編輯修改稿)
2025-01-31 05:59 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 tccaaattgtaa 熒光酶基因突變位點測序圖 G →C , 導(dǎo)致第 245位氨基酸置換 (His→Gln) 測序單位：上海生工 GC →AG, 導(dǎo)致第 215位氨基酸置換 (Ala→Leu) 熒光酶表達 電泳圖 純化后電泳圖 熒光酶蛋白質(zhì) 電泳圖 0%20%40%60%80%100%0 5 10 15 20 25 30 3537度孵育時間（min）殘留活性M245突變型熒光酶M215突變型熒光酶野生型熒光酶圖 1：野生型和突變型熒光酶熱穩(wěn)定性比較 野生型和突變型熒光酶活性比較 100100010000100000100000010000000250 ATP濃度（ng/ml）熒光強度（RLU）M245突變型熒光酶野生型熒光酶圖 2：野生型和突變型熒光酶發(fā)光效率及線性關(guān)系比較 ? 重組 熒光酶制劑穩(wěn)定性研究 放置 溫度 活性半衰期 液體保存 凍干品 20℃ 80天 360天 4℃ 20小時 180天 25℃ 21天 37℃ 3天 因此，我們將熱穩(wěn)定性和發(fā)光效率均好的M245突變熒光酶凍干制劑作為藥敏檢測用酶制劑 *重組熒光酶為 M245突變型熒光酶 腫瘤細胞選擇性培養(yǎng)基研究 0121 2 3 4 5 6 7培養(yǎng)時間（天）熒光強度（10E+05 RLU）MCF7A549Eca109選擇性培養(yǎng)基生長支持度及選擇性研究 1101 2 3 4 5 6 7培養(yǎng)時間（天）熒光強度（10E+05 RLU）正常組織良性組織腫瘤組織淋巴細胞腫瘤細胞系生長曲線 正常、良性卵巢及腫瘤組織培養(yǎng)生長曲線 新鮮瘤組織體外培養(yǎng)效果圖 Continued 卵巢癌原代培養(yǎng)前后 HE及免疫組化染色 PANKERATIN染色 正常卵巢上皮細胞及成纖維細胞 培養(yǎng)結(jié)果 正常上皮細胞培養(yǎng)抑制效果圖 成纖維細胞培養(yǎng)抑制效果圖 培養(yǎng)前后細胞組成變化 培養(yǎng)前細胞組成 6天培養(yǎng)后細胞組成 淋巴 上皮 成纖維 腫瘤 淋巴 上皮 成纖維 腫瘤 細胞 細胞 細胞 細胞 細胞 細胞 細胞 細胞 4050% 1025% 510% 1020% 1% 10% 10% 75% 選擇性培養(yǎng)基的研究結(jié)果表明該培養(yǎng)基具有良好的選擇性，適合腫瘤體外藥敏檢測的需要 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 培養(yǎng)基對腫瘤細胞生長支持程度 以 MCF7細胞系作為標(biāo)準(zhǔn)細胞系 ， 按 2022個細胞 /孔接種濃度接種至 96孔培養(yǎng)板中 ， 培養(yǎng)七天后 ， 要求測定的 RLU值 400000。 ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線 將 ATP標(biāo)準(zhǔn)品配成 250ng/ml， 倍比 (3 )稀釋 7次 ， 做出 ATP濃度與 RLU（ 扣除本底吸收值 ） 的標(biāo)準(zhǔn)曲線 ， 要求： r， 最小 ATP濃度 （ ）的 RLU400。 精密度 選 MCF7細胞系低 、 中 、 高 （ 500、 10000、 40000個 ） 數(shù)目的細胞 ， 分別測定十組 RLU值 ， 要求： CV10% 敏感度 50個 MCF7細胞 440RLU， 同時本底值 200 RLU。 第三部分 ATPTCA體外藥敏檢測技術(shù)的臨床應(yīng)用研究 ATPTCA 藥物測試方式 評價標(biāo)準(zhǔn) 強敏感 (SS)： IC5025%及 IC90100%PPC 中度敏感 (IS)： IC5025%及 IC90100%PPC 輕度敏感 (MS)： IC5025%及 IC90100%PPC 耐藥 (R)： IC5025%及 IC90100%PPC IC90:抑制 90%腫瘤細胞生長的血漿峰值濃度百分比 IC50:抑制半數(shù)腫瘤細胞生長的血漿峰值濃度百分比 PPC:一定臨床用藥劑量對應(yīng)的血漿峰值濃度 臨床相關(guān)性研究病人資料 病例數(shù) 34 年齡 腫瘤類型 5 3 (3 4 74 ) y rs . 上皮性卵巢癌 生殖細胞腫瘤 標(biāo)本類型 實體瘤標(biāo)本 32 2 28 腹水標(biāo)本 手術(shù)病理分期（ F I G O ） Ⅰ ～ Ⅱ Ⅲ ～ Ⅳ 6 18 16 紫杉醇 + 卡鉑方案耐受病人 8 表 1：卵巢癌體外藥敏檢測與臨床療效的比較 臨床相關(guān)性研究初步結(jié)果 例數(shù) 體外檢測 體外檢測 敏感 (SS+IS) 耐藥 (WS+R) 共計 體內(nèi)敏感（ CR+PR） 體內(nèi)耐藥（ SD+PD） 18 2 20 1 11 12 共計 19 13 32 *34例卵巢癌中可評價標(biāo)本為 32例，標(biāo)本可評價率為 % 表 2：卵巢癌體外藥敏檢測真實性評價 陽性預(yù) 測值 陰性預(yù) 測值 靈敏度 特異性 % % % 90% % 整體預(yù) 測值 ATPTCA藥敏檢測的臨床應(yīng)用 1. 設(shè)計個體化治療方案 2. 研究新的聯(lián)合化療方案 3. 化療藥物新適應(yīng)癥研究 一例經(jīng)多重化療復(fù)發(fā)的睪丸癌病人藥敏檢測結(jié)果 020406080100100 50 25 Test Drug Concentration (%)Tumor Growth Inhibition (%)DDP+VP16+VCR GEM+DDP CTX+ADM+CBPVP16+CBP GEM+THP BLM+CTX+ACTDBLM+VP16+CBP
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