【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 基硫酸酯酶 ） 和溶劑解三種 。 所謂溶劑解即是指某些藥物和硫酸結(jié)合所形成的酯 ， 可以隨加入的萃取溶劑在萃取時(shí)發(fā)生分解 。 （ 3） 液 液萃取的原理與應(yīng)用 血樣與尿樣中藥物組分的分離最常用的方法是液 — 液萃取法 。 掌握液 — 液萃取的基本原理對(duì)于藥物定量分析具有重要應(yīng)用意義 。 ① 分配系數(shù) 液 — 液萃取也叫溶劑萃取。選用與水不相混溶的有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，是利用藥物在水與非水兩個(gè)相中分配不均勻的特性為基礎(chǔ)的一種分離提取法。當(dāng)分配達(dá)到平衡時(shí)，待測(cè)藥物組分在兩個(gè)溶劑中的濃度比在一定的溫度條件下和 pH值條件下為一常數(shù)。 在水相與非水相中分布達(dá)到平衡時(shí) ， 則有分配系數(shù) （ ） 其中 ， kd為分配系數(shù) ， 與溶質(zhì) （ 待測(cè)藥物 ） 、 溫度 、 溶劑對(duì)和各相的 pH相關(guān)； [A非 ]和 [A水 ]分別代表藥物在非水相和水相中平衡時(shí)的濃度 。 ]/[][ 水非 AAk d ?② 分配比 在液 — 液萃取過(guò)程中 ， 藥物在水相和非水相中常以多種形式存在 ， 如離解態(tài) ， 聚合態(tài) ， 絡(luò)合態(tài)或與其他組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)等等 。 實(shí)際上 ， 每一種形態(tài)在兩相中都有各自的分配系數(shù) ，不能用單一的分配系數(shù)來(lái)表征萃取過(guò)程中的平衡問(wèn)題 。 在藥物分析時(shí) ， 實(shí)際最注重考慮的是藥物在兩相中的總濃度 ， 很少考慮各種形式的濃度 。 不考慮藥物在兩相中所存在的形式 ， 將藥物在水相和非水相的總濃度之比定義為分配比 ， 用符號(hào) D表示 （ ） 容易看出 ， 當(dāng)兩相的體積相等時(shí) ， 如分配比 D大于 1， 則表示藥物在非水相分配的量高于在水相中的量 。 水非水水水非非非][][][][][][][][2121CCAAAAAADnn ?????????? 值得說(shuō)明的是只有當(dāng)藥物在兩相中的存在形式完全相同時(shí) ，分配比 D才等于分配系數(shù) kd。 ③ 萃取率 萃取率表平衡時(shí) ， 藥物在有機(jī)相中的量與藥物總量之比 。 設(shè) V非 和 V水 分別為萃取時(shí)有機(jī)相 （ 非水相 ） 和水相的體積 ，[C]非 和 [C]水 分別代表藥物在非水相和水相中的濃度 ， 則萃取率為 100][][ ][100% ???? ????水水非非非非藥物在兩相中的總量藥物在有機(jī)相中的總量VCVCVCE根據(jù) D=[C]非 /[C]水 可知 （ ） 當(dāng)非水相和水相的體積相等時(shí) ， 則有 E%=D（ D+1） 100 100)/(% ???非水VVDDE 根據(jù)上述關(guān)系可知當(dāng)分配比分別為 100和 1000時(shí) ， 其相應(yīng)的萃取率為 50%、 91%、 99%和 %。 即如果一次萃取要求E%達(dá)到 %， 則藥物在兩相中的分配比應(yīng)大于 1000。 在實(shí)際工作中 ， 如果 D值不充分大時(shí) ， 應(yīng)該分次加入有機(jī)溶劑進(jìn)行多次連續(xù)萃取 ， 以提高其萃取分離的效率 。 就一般血藥濃度分析的基本要求而言 ， 萃取率不應(yīng)低于 50%。 ④ 影響萃取分離的因素 影響藥物萃取率的因素包括萃取系統(tǒng)的酸堿度 （ pH值 ） 、 藥物的電離速率常數(shù) （ pKa值 ） 以及萃取所選擇的有機(jī)相 、 萃取時(shí)間及其溫度等 。 水相的 pH值：大多數(shù)體內(nèi)使用藥物相對(duì)機(jī)體來(lái)說(shuō)都屬于弱酸或弱堿性化合物。根據(jù)這一特點(diǎn)，可使用酸或堿使藥物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的鹽而溶于極性溶劑水中，再調(diào)節(jié)樣品的 pH值，使離子型藥物轉(zhuǎn)變成非電離型（分子型）而溶于非極性溶劑中。 在實(shí)際工作中，主要是根據(jù)藥物的 pKa值來(lái)確定水相的 pH值。根據(jù)化學(xué)原理可知，當(dāng)水相 pH=pKa值時(shí)，有 50%的藥物以非電離形式存在。 水相最佳 pH值可根據(jù) HendersonHasselbalch方程計(jì)算求出： pH=pka+lg[A]/[HA] （ ） 其中 [A]和 [HA]分別表示藥物的堿式和酸式濃度。 例如苯巴比妥的 pKa值為 。 假設(shè)某動(dòng)物正常血漿的 pH值為 ， 則血漿中解離的藥物濃度 [A]與非解離的藥物濃度 [AH]之比應(yīng)為 =+lg[A]/[AH] [A]/[AH]= 說(shuō)明只有 %的藥物是以未解離形式存在。被有機(jī)溶劑提取的比例不高。 為了提高其萃取率 ， 將 pH值調(diào)至 =+lg[A]/[AH] [A]/[AH]= 說(shuō)明在此條件下有 97%以上的藥物可被提取 。 值得注意的是上述這一規(guī)則對(duì)于高度電離的極性化合物 ，如季銨鹽類(lèi) （ 氨基甙類(lèi)抗生素 ） 或具有兩性化合物性質(zhì)的藥物（ 四環(huán)素類(lèi)藥物 ， 磺胺類(lèi)藥物 ， 氟喹諾酮類(lèi)藥物 ） 以及有形成兩性離子傾向的化合物并不適合 。 這 些藥物較難被定量萃取分離出來(lái) 。 可采用離子對(duì)技術(shù)提取和定量 。 根據(jù) HendersonHasselbalch方程可以估測(cè) ， 弱堿性藥物的最佳 pH值應(yīng)高于其 pKa值 23個(gè)單位 。 酸性藥物萃取的 pH值應(yīng)低于其 pKa值 23個(gè)單位 。 盡可能選擇極性較小的溶劑 。 提高其萃取的回收率 。 減少干擾 “ 雜質(zhì) ” 的提取量； 在萃取過(guò)程中加入少量的醇類(lèi) ， 以減少容器表面對(duì)藥物的吸附 。 液 — 液萃取常用的有機(jī)溶劑見(jiàn)表 112。 溶劑 影響液 液萃取的效率的另一個(gè)主要因素就是有機(jī)相品種 。通常液 液萃取的水相就是生物樣品相 （ 血漿 、 血清 、 尿液 ） 。另一液相有機(jī)相是必須通過(guò)比較來(lái)進(jìn)行選擇的 。 選擇有機(jī)相的基本原則是： 滿足萃取的需要 ， 盡可能提高其萃取率 ， 即選擇對(duì)被提取物有較大親合力 ， 與水互不相溶的有機(jī)溶劑 。 表 112 液 液萃取常用有機(jī)溶劑 品種 極性 （ ε 176。 Al2O3） UV截止波長(zhǎng) （ nm） 水中溶解度 （ %（ W/W）20℃ ） 沸點(diǎn) （ ℃ ） 正已烷 190 69 異辛烷 197 99 環(huán)已烷 200 81 四氯化碳 265 77 甲苯 285 110 乙醚 218 35 苯 280 80 烷 230 83 氯仿 245 61 二氯甲烷 233 40 乙酸乙酯 256 77 丙酮 330 互溶 56 乙腈 190 互溶 82 異丙醇 205 互溶 82 乙醇 210 互溶 78 甲醇 205 互溶 65 —— 引自姚彤煒 . 體內(nèi)藥物分析 ， 浙江大學(xué)出版社 ， 2021年 3月版 ， 53頁(yè) . 離子強(qiáng)度： 在水相中加入水溶性強(qiáng)的中性鹽如硫酸鈉 、 氯化鈉 、 硫酸銨等 ， 可以增加離子強(qiáng)度 ， 使溶液中水分子與無(wú)機(jī)離子強(qiáng)烈締合 ， 導(dǎo)致藥物在水相中的溶解度下降 。 分配到有機(jī)相中的比例增加 ， 提高其萃取率 。 加入無(wú)機(jī)鹽還能減少藥物在有機(jī)溶劑與水相間提取時(shí)發(fā)生乳化 ， 有利于提取的操作 。 ⑤ 液 — 液萃取的操作步驟 在選好有機(jī)相后 ， 可根據(jù)樣品的體積按下列步驟萃?。? 萃?。河?60125ml容積的梨形分液漏斗進(jìn)行萃取 ， 也可在帶塞的試管中進(jìn)行 ， 以便振搖 。 萃取的時(shí)間決定于藥物在有機(jī)相達(dá)到分配平衡的速度 ， 通常為 1分鐘到數(shù)分鐘不等 。 靜置分層：通常在旋渦振蕩儀上振搖萃取后 ， 靜置梨形分液漏斗或萃取試管 ， 使水相與有機(jī)相分開(kāi) ， 然后將兩相分離 。 洗滌：在液 — 液萃取過(guò)程中 ， 血液中的干擾組分也可能進(jìn)入有機(jī)相中 ， 當(dāng)干擾組分的分配比較小時(shí) ， 可用洗滌的方法除去 。 洗滌液的基本組成與試液相同 ， 不含藥物 。 （ 在樣本為血清或血漿時(shí) ， 洗滌液即為空白血清或空白血漿 ） 。 將分出的有機(jī)相與洗滌液一起振蕩 ， 對(duì)測(cè)定干擾較大分配比小的雜質(zhì)用反萃取方法使之進(jìn)入水相 。 ⑥ 液 — 液萃取問(wèn)題及處理方法 在萃取過(guò)程中 ， 萃取液靜置分層時(shí) ， 在兩相交界處有時(shí)會(huì)出現(xiàn)一層乳濁液 ， 有時(shí)整個(gè)兩相液體全部發(fā)生乳化 ， 造成水相與有機(jī)相分離不全或完全不能分離 ， 此時(shí)可采用下列方法進(jìn)行處理： 增大有機(jī)溶劑用量； 萃取前在水相中加入適量電解質(zhì)如氯化鈉 ， 減輕乳化程度； 改變?nèi)芤旱?pH值 ， 避免在過(guò)高 pH值條件下從水相中提取藥物； 避免使用容易發(fā)生乳化的溶劑對(duì) ， 如水與已烷 ， 水與苯 ， 選用具有高的界面張力和密度差異大的溶劑 。 避免過(guò)激振蕩 （ 振搖 ） 。 加乙醇或少量高級(jí)脂肪酸 ， 改變表面張力 ， 以利于破壞乳化 。 萃取分離時(shí)藥物被容器吸附 ， 血樣中某些成分對(duì)藥物的吸附 ， 使萃取效率降低 ， 此時(shí)可采用下列方法處理： 對(duì)玻璃器皿進(jìn)行硅烷化處理：可用含 1%的三甲基一氯硅烷的甲苯溶液對(duì)干燥玻璃試管淌抹一次 ， 然后在 100℃ 條件下干燥 30min。 也可用含 10%的二甲基二氯硅烷的甲苯溶液充滿干燥玻璃試管 ， 放置 30分鐘傾出 ， 依次用甲苯 、 甲醇淌洗 ，然后烘干備用 。 在不影響藥物的測(cè)定時(shí) ， 可加少量異戊醇 、 二乙胺來(lái)降低玻璃容器對(duì)藥物的吸附 。 ⑦ 液 — 液萃取的應(yīng)用 藥物動(dòng)力學(xué)研究中，體液中藥物的定量分析前的分離與富集最常用的方法就是液 — 液萃取。生物體液中藥物如嗎啡含量的測(cè)定時(shí)，如果嗎啡是以游離的形式存在，在 pH值為 ，可直接由尿中萃取入 4： 1的二氯甲烷和異丙醇中。然而，隨尿排出的嗎啡，只有 15%游離的， 85%是與葡萄糖醛酸結(jié)合成酯。而成酯的結(jié)合型嗎啡是難以萃取進(jìn)入有機(jī)相的。 因此 ， 在萃取前 ， 應(yīng)將尿液用硫酸酸化 ， 并在約 90℃ 加熱 15分鐘 。 使結(jié)合型嗎啡發(fā)生酸水解 。 使嗎啡游離出來(lái) 。 在水解過(guò)程中 ， 可能增加尿中其他干擾成分進(jìn)入有機(jī)相 。 因此 ， 萃取物應(yīng)通過(guò)反萃取使嗎啡進(jìn)入稀鹽酸中 ， 讓其他干擾物質(zhì)存留于有機(jī)相 ， 而達(dá)到提純嗎啡的作用 。 再調(diào)節(jié) pH=， 以二氯甲烷 — 異丙醇重新萃取嗎啡 。 再用氣相色譜法測(cè)定其含量 。 藥物或代謝物 生物樣本 萃取方法 氟甲砜霉素 血漿 血漿樣品按 1： 3體積比加乙酸乙酯提取 2次 ， 合并有機(jī)相 ，在 60℃ 條件下氮?dú)獯蹈?， 流動(dòng)相 [乙腈 水 （ 78： 22） ]溶解 。 諾氟沙星 血清、乳汁 2ml萃取 ， 在旋渦振蕩儀上振蕩 15秒鐘后在 3000 g速度下離心 10分鐘 。 收集上清液加入 2ml正乙烷和 2ml二氯甲烷 ， 混合液在 2021 g速度下離心 ， 取下層水相進(jìn)入 HPLC系統(tǒng)分析 。 體液中藥物定量分析 常見(jiàn)的分析方法有光譜法 、 免疫分析法 、 色譜法 、 手性