實驗四pcr及電泳技術(shù)(編輯修改稿)
2025-06-17 08:55 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 e = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon PCR儀 PCR儀 PCR儀 PCR反應(yīng)成分 1）模板 單、雙鏈 DNA或 RNA都可以作為 PCR的樣品。若起始材料是 RNA，須先通過逆轉(zhuǎn)錄得到第一條 cDNA。 一般 100ng DNA模板 /100?l。 模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。 最好做濃度梯度對照從而確定最佳條件。 PCR反應(yīng)體系 模板 引物 Taq DNA聚合酶 4種 dNTP混合物 Mg2+ 10 緩沖液 2）引物 （ 1）濃度 ?M 濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配，反應(yīng)特異性下降。 ? 引物是 PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵； ? PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板脫氧核糖核酸互補的程度； ? 人工合成的寡聚核苷酸引物需經(jīng)離子交換 HPLC進行純化。 3） Taq DNA聚合酶 ? 一般 U/50?l； ? 酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量；濃度過高可引起會造成雜帶、特異產(chǎn)物帶不清晰等不好的結(jié)果，濃度過低則得不到所需的產(chǎn)物。最可靠的做法是先做濃度對照 ,再根據(jù)結(jié)果決定最佳條件。 4） dNTP (dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP 4） ? dNTP濃度取決于擴增片段的長度 。 ? 四種 dNTP濃度應(yīng)相等 。 ? PCR常用的濃度為 50200μM，不能低于 1015μM。 濃度過高 會抑制 Taq 酶的活性， 易產(chǎn)生錯誤堿基的 摻入，濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量 5） 10 PCR緩沖液 (Mg2+)： 500 mM KCl， 100 mM TrisHCl (pH )， 150 mM MgCl2 ， 1 mg/ml明膠。 PCR反應(yīng)體系： 10 PCR buffer dNTP mix
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