雙向電泳原理及實驗步驟(編輯修改稿)
2025-05-26 04:57 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 間。 ? 聚焦最佳時間由不同蛋白樣品、上樣量、 pH范圍和膠條長度通過經(jīng)驗來確定。 ? 聚焦時間太短，會導(dǎo)致水平和垂直條紋的出現(xiàn)。 ? 過度聚焦雖然不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)向陰極漂移，但會因為活性水轉(zhuǎn)運而導(dǎo)致過多水在 IPG膠表面滲出（電滲）而造成蛋白圖譜變性，在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋以及蛋白丟失。 IEF的基本條件 Stemp 1 Stemp 2 Stemp 3 total voltage Time VoltHours Ramp 250 20min －－－ Linear 4000 4000 2hr －－－ －－－ 10,000Vhr Linear Rapid 5 hr 14,000Vhr 7 cm Stemp 1 Stemp 2 Stemp 3 total total Stemp 1 Stemp 2 Stemp 3 11 cm 17 cm 250 250 8000 10000 10000 8000 20min 20min －－－ －－－ －－－ －－－ －－－ －－－ 20,000Vhr 40,000Vhr ～ 30,000Vhr ～ 50,000Vhr hr 7 hr Linear Linear Linear Linear Rapid Rapid 兩維間的平衡 ? 等電聚焦電泳結(jié)束后可馬上進行第二向電泳，也可于－ 80176。 保存數(shù)月。 ? 但在第二向電泳前一定要進行膠條的平衡，以便于被分離的蛋白質(zhì)與 SDS完整結(jié)合，從而使 SDSPAGE電泳能順利進行。 ? 建議方案： 用含 2%(m/v)SDS、 1%(m/v)DTT、 6mM尿素和 30%甘油的 50mM Tris（ ）緩沖液先平衡15min，再用 5%(m/v)碘乙酰胺取代 DTT后的上述緩沖液平衡 15min。如果用 TBP代替 DTT則只需一步平衡。 二維 SDSPAGE ? 同普通 SDSPAGE類似。 ? 但一般在垂直電泳系統(tǒng)中無需濃縮膠，因為在 IPG膠條中蛋白質(zhì)區(qū)域已得到濃縮，可以認(rèn)為非限制性 IEF膠（低濃度丙烯酰胺膠）充當(dāng)了濃縮膠。 Second Dimension SDSPAGE Multiple Gel Formats Mini Criterion PROTEAN 1176。 : 60 ?g sample, 20 kVhr 2176。 : x cm, 40 min 944 spots 1176。 : 100 ?g sample, 50 kVhr 2176。 : x cm, 1 hr 1,287 spots 1176。 : 150 ?g sample, 80 kVhr 2176。 : x cm, hr 1,724 spots 聚丙烯酰胺凝膠和轉(zhuǎn)印到膜上的蛋白質(zhì)的檢測 理想顯色劑的 7S ? 安全 （ safety） ： ? 靈敏 （ sensitivity） ： ? 簡單 （ simplicity） ： ? 特異性 （ specificity） ： ? 快速 （ speed） ： ? 穩(wěn)定 （ stability） ： ? 兼容性 （ synergy） ： 適用于質(zhì)譜的染色方法 ? 考馬斯亮蘭（ BioSafe? Coomassie? colloidal 250 stain） ? 銀染（ Silver Stain Plus? stain ） ? 熒光染色（ SYPRO174。 Ruby protein gel stain） 考馬斯亮藍染色 ? 考馬斯亮藍檢測范圍 30100ng，靈敏度較低，但染色過程簡單，所需試劑少，操作簡便，無毒性，染色后背景及對比度好，與下游質(zhì)譜兼容，線性程度好。 ? 膠體考馬斯亮藍染色的檢測靈敏度為 810ng，但染色時間較長（ 2448小時），染色過程給下游質(zhì)譜檢測帶來較多不便。 ? BioSafe染料 是一種改良的膠體金染色方法。安全無污染，染色非常快（ 2小時），完全與下游質(zhì)譜兼容。 銀染 ? 銀染的檢測靈敏度很高，可達到 200pg，但其線性很差。普通的銀染過程中因醛類的特異反應(yīng)，而與下游質(zhì)譜不兼容。
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