wb原理、步驟及總結(編輯修改稿)
2025-07-22 23:50 本頁面
【文章內容簡介】 平搖床上不斷振搖，洗膜3次，每次5min。（除去封閉液）③漂洗完后，將膜轉移至雜交袋中，加入特異性一抗，4℃搖床過夜或室溫放搖3h（一抗與目的抗原蛋白特異性結合）④利用水平搖床，用TBST洗膜3次，每次5min。（洗去未結合的一抗）⑤將膜轉移到稀釋的酶標二抗中，在室溫下孵育30min⑥傾去二抗，用TBST洗膜，室溫搖洗三次，每次5min，蛋白面朝上，置于保鮮膜中，將ECL的A液和B液以1:1體積混合，于暗室中，㎝2的量滴加于膜表面，孵育1min，濾紙吸去多余液體用保鮮膜包好，立即于暗室內曝光數秒。在暗室中，將 1顯影液和定影液分別到入塑料盤中；在紅燈下取出 X－光片，剪裁適當大小（比膜的長和寬均需大 1cm）；打開 X光片夾，把 X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移動，關上X光片夾，開始計時；根據信號的強弱適當調整曝光時間，一般為 1min 或 5min，曝光完成后，打開X光片夾，取出 X光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時間一般為 1～2min（20～25℃），溫度過低時（低于 16℃）需適當延長顯影時間；顯影結束后，馬上把 X光片浸入定影液中，定影時間一般為 5～10min，以膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。注意事項①在合適的鹽濃度下，應保持蛋白質的最大溶解性和可重復性；②不同濃度的凝膠用于分離不同相對分子質量的蛋白③選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價結合的蛋白質復合物和共價鍵、二硫鍵；對于多亞基蛋白或含多條肽鏈的蛋白，SDS—PAGE只能測定它們的亞基或單條肽鏈的相對分子質量。④盡量除去核酸、多糖、脂類等干擾分子；⑤蛋白質樣品在處理過程中應低溫下進行，以避免細胞破碎釋放出各種酶對其進行修飾⑥盡量使用新鮮的loading buffer，樣品要與loading buffer混合均勻，⑦不可將蛋白質反復凍融使用以防改變蛋白質的抗原特性，⑧Buffer一定要漫過梳子孔，否則可能會發(fā)現蛋白跑不動；⑨電泳時先用低電壓跑過濃縮膠，再換高電壓跑分離膠，特別是對于高分子量的目的蛋白，⑩硝酸纖維素（NC)膜：NC與蛋白質靠疏水作用結合，無需預先活化，對蛋白質的活性影響小； 非特異性本底顯色淺；價格低廉，使用方便。但結合在NC上的小分子蛋白質在洗滌時易丟失； NC韌性較差，易損壞。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜：與蛋白質親和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正電基團，使其更容易與帶負電荷蛋白結合。但價格上稍貴。為了便于觀察電泳效果和轉膜效果，以及判斷蛋白分子量大小要先將膜晾干，然后浸入20%的甲醇，待完全浸濕后取出透光觀察即可看到蛋白條帶（適用于PVDF膜）。傳統(tǒng)方法是將膜用1麗春紅染液染5min（于脫色搖床上搖），然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。從轉膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥
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