wb的轉(zhuǎn)膜和染色(編輯修改稿)
2025-08-31 23:22 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 使用NC膜時(shí)才必需使用甲醇。如果是 PVDF膜，在甲醇激活膜后，轉(zhuǎn)膜緩沖液中可以不加入甲醇。 選擇濕轉(zhuǎn) 4176。C 過(guò)夜，不建議選擇半干轉(zhuǎn)。?小分子蛋白(100 kD)??SDS 妨礙蛋白與膜的結(jié)合，對(duì)于小分子蛋白更是如此。因此小分子蛋白的轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜緩沖液中可以不加 SDS。保持甲醇的濃度20%。對(duì)于500 kD 的蛋白，請(qǐng)參考下列文獻(xiàn)的凝膠和緩沖液系統(tǒng)：Bolt MW and Mahoney PA (1997).Highefficiency blotting of proteins of diverse sizes following sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel Biochem?, 247, 185–92.更多轉(zhuǎn)膜提示： 使用鑷子，避免手指接觸膜。手指上的油和蛋白會(huì)阻礙轉(zhuǎn)膜，形成臟的印跡。 將凝膠和膜夾在濾紙中間后，兩者之間的氣泡可以通過(guò)滾筒、移液管或者 15 mL 管滾壓三明治結(jié)構(gòu)來(lái)去除，或者在裝有轉(zhuǎn)膜緩沖液的盤中組裝三明治結(jié)構(gòu)，防止氣泡形成。 確保將濾紙和膜的大小剪裁得與凝膠一致。在半干轉(zhuǎn)中，較大的突出會(huì)阻止電流通過(guò)膜。 雞來(lái)源的抗體會(huì)結(jié)合在 PVDF膜上，形成高背景。改用NC膜可以幫助降低背景染色。麗春紅染色使膜上蛋白可視化要確定轉(zhuǎn)膜的成功，用TBST洗膜。將麗春紅母液按照1:100稀釋。母液是2%的麗春紅S加入30%的三氯乙酸和30%的磺基水楊酸制成。在麗春紅染色液中孵育5分鐘，然后用大量水沖洗直至水清澈、蛋白條帶顯現(xiàn)。該膜可以用TBST或水重復(fù)沖洗至完全脫色。對(duì)于PVDF膜，用甲醇重新激活后，再用TBST清洗。TBS 10x1 L溶液； g TrizmaHCl g NaCl
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