westernblot實驗步驟(編輯修改稿)
2025-06-16 00:52 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 G250溶于 50mL95%乙醇，加入 100mL85%(W/V)磷酸，將溶液用水稀釋到 1000mL，過濾。試劑的終濃度為 %考馬斯亮藍 G250， %(W/V)乙醇，和 %(W/V)磷酸。 ? 實驗步驟： 96孔板，對照 20μ l PBS,測定蛋白樣品 :18μ l+2μ l蛋白，加入 200μ l考馬斯亮蘭溶液，放置 2分鐘（在一個小時內(nèi)測，時間變長，可能會產(chǎn)生沉淀），酶標(biāo)儀上 595nm處測定吸光值，這樣只能相對定量蛋白，如果要定量蛋白，可以用不同梯度的 BSA做標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量蛋白 輝駿生物： 免費服務(wù)熱線： 4006991663 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 原理 ： SDS 是一種陰離子表面活性劑 .當(dāng) SDS 與蛋白質(zhì)混合時 ,它會以其碳鏈與蛋白質(zhì)之疏水性胺基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來 ,而以硫酸根離子外露與水分子作用 .大多數(shù)蛋白質(zhì)和 SDS 的平均結(jié)合量是 1: (以重量為單位 ),而蛋白質(zhì)結(jié)合固定比例之 SDS后 ,由于 SDS 帶強負價 ,使蛋白質(zhì)原先的帶電價微不足道 ,且每單位重量之蛋白質(zhì)帶電價一致 (charge density),所以決定不同蛋白的泳動速率就只剩下分子大小一項因素 。 輝駿生物： 免費服務(wù)熱線： 4006991663 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 電泳注意： （ 1） 所有蛋白樣品定量一致 ， 體積以一致 ， 不夠的用裂解液補滿 ， 樣品兩側(cè)的泳道用等體積的 1 loading buffer上樣 ， Marker也用 1 loading buffer調(diào)整至與樣品等體積 ， 這樣可以避免最邊上的孔道電泳時出現(xiàn)擴散 ，使最邊上的孔道電泳出現(xiàn)誤差 。 （ 2） Western Blot一般上樣 30－ 100微克不等 ， 結(jié)果跟目的蛋白的豐度 、上樣量 、 一二抗的量和撫育時間都有關(guān)系 ， 也與顯色時間長短有關(guān) 。 開始摸條件時 ， 為了拿到陽性結(jié)果 ， 各個步驟都可以量多一點時間長一點 ， 當(dāng)然背景也就出來了 。 （ 3） 濃縮膠的目的使得 lo
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