westernblot實驗技術(shù)(1)(編輯修改稿)
2025-06-16 00:52 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 2）室溫下振搖溫育４ｈ至過夜； （ 3）去除染色液，收集保存可重復(fù)使用 2040次； （ 4）依次在 25%甲醇和 %乙酸中室溫振搖下脫色。靈敏度為 ／每條帶。 ? 注：使用加熱的染色液或脫色液可以縮短染色或脫色時間。將染色液或脫色液在微波爐或水浴中加熱，（大約 5060℃ ），染色時間可縮短至 20min,脫色時間約 12h。 操作圖示 注意事項 （ 1） 所有蛋白樣品定量一致 ， 體積一致 ， 不夠的用裂解液補(bǔ)滿 ， 樣品兩側(cè)的泳道用等體積的 1 loading buffer上樣 ， Marker也用 1 loading buffer調(diào)整至與樣品等體積 ， 這樣可以避免最邊上的孔道電泳時出現(xiàn)擴(kuò)散 ， 使最邊上的孔道電泳出現(xiàn)誤差 。 （ 2） Western Blot一般上樣 30－ 100微克不等 ， 結(jié)果跟目的蛋白的含量 、 上樣量 、 一二抗的量和孵育時間都有關(guān)系 ， 也與顯色時間長短有關(guān) 。 開始摸條件時 ， 為了拿到陽性結(jié)果 ， 各個步驟都可以調(diào)整 。 （ 3） 積層膠的目的使得 loading 的樣品能夠在同一條水平線上進(jìn)入分離膠 ，如果電壓太大前端的蛋白容易在后面的蛋白趕上來前進(jìn)入分離膠 。 而在分離是理論上小電壓長時間分離的效果會更好 ， 濃縮膠 80v， 分離膠 100v就能跑得很好 ， 同時制膠前一定要使膠混勻 ， 雙蒸水隔離時 ， 一定要比較輕地加上去 ，避免稀釋上層的分離膠 ， 使膠不均勻 。 （ 4） pH對整個反應(yīng)體系的影響是至關(guān)重要的 ， 在 SDS－ PAGE不連續(xù)電泳中 ，制膠緩沖液使用的是 Tris－ HCL緩沖系統(tǒng) ， 積層 膠是 ， 分離膠 ；而電泳緩沖液使用的 Tris－甘氨酸緩沖系統(tǒng) ， PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理： 一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián)，反復(fù)洗幾次后，蛋白容易掉下來，結(jié)果較差，背景相對較弱。 尼龍膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合（注：常用的 PVDF即帶正電荷的尼龍膜），同時也有疏水作用，但相對較弱， PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結(jié)果較好，但背景相對較強(qiáng)。 分類： 半干法和濕法轉(zhuǎn)移是兩種不同的轉(zhuǎn)移裝置下的轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，將膜，膠，濾紙整個浸泡在 buffer的 Tank里轉(zhuǎn)移的，叫濕法；用濾紙吸buffer來做轉(zhuǎn)移體系的叫半干法。 BIORAD的半干轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的弱點就是無法控溫，當(dāng)電流過高，而系統(tǒng)的散熱又比較差，濾紙的吸水性比較差的情況下，就很容易燒膠。 轉(zhuǎn)膜 轉(zhuǎn)膜步驟 半干實驗步驟： 先將 PVDF膜在甲醇中浸泡約 30s,在放入轉(zhuǎn)膜緩沖液里浸泡數(shù)分鐘。每塊膠用 60mA， 1h，從下到上的順序：陰極 /濾紙 /PVDF膜 /凝膠 /濾紙 , 凝膠面向陰極，保持濕潤和沒有氣泡。必要時可先用麗春紅染色（ 2%乙酸， %麗春紅的水溶液）觀察蛋白條帶轉(zhuǎn)移到膜上的效率。 濕轉(zhuǎn)實驗步驟：
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