病毒轉(zhuǎn)染原理及步驟docxdocx(編輯修改稿)
2025-08-14 12:38 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 引入酶切位點(diǎn)，PCR(采用高保真KOD酶，3K內(nèi)突變率為0%)從模板中（CDNA質(zhì)?；蛘呶膸欤┱{(diào)取目的基因CDS區(qū)（coding sequence）連入T載體。將CDS區(qū)從T載體上切下，裝入慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒載體。合成siRNA對應(yīng)的DNA頸環(huán)結(jié)構(gòu)，退火后連入慢病毒干擾質(zhì)粒載體3. 慢病毒載體的包裝與濃縮純化制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒，三種質(zhì)粒載體分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素抽提，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6 h 更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24和48h后，分別收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，病毒上清液通過超離心濃縮病毒。（二） 實(shí)驗(yàn)材料：慢病毒載體、包裝細(xì)胞和菌株該病毒包裝系統(tǒng)為三質(zhì)粒系統(tǒng)，組成為pspax2, pMD2G, pLVXIRESZsGreen1/pLVXshRNA2。其中質(zhì)粒上的ZsGreen1表達(dá)框能表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）。細(xì)胞株 293T，慢病毒的包裝細(xì)胞，為貼壁依賴型成上皮樣細(xì)胞，生長培養(yǎng)基為DMEM(含10% FBS)。貼壁細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)生長增殖形成單層細(xì)胞。 菌株大腸桿菌菌株DH5α。用于擴(kuò)增慢病毒載體和輔助包裝
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