【文章內(nèi)容簡介】 胞數(shù)據(jù)比腫瘤數(shù)據(jù)更豐富也更系統(tǒng) ,我們將在惡性腫瘤 與干細(xì)胞中分別預(yù)測基因表達(dá)與表觀調(diào)控網(wǎng)絡(luò) ， 并進(jìn)一步比較其異同。通過干擾預(yù)測的上游調(diào)控節(jié)點后以 ChIPPCR 和 ChIPseq 技術(shù)對下游節(jié)點進(jìn)行檢測，對以上預(yù)測模型中的關(guān)鍵調(diào)控關(guān)系進(jìn)行驗證。為了通過實驗驗證貝葉斯網(wǎng)絡(luò)模型推測出來的因果關(guān)系，我們將把它們作為遺傳學(xué)的上下游關(guān)系處理。這樣 就可以人為 地 提高或降低上游事件的水平，例如，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合或者其他組蛋白修飾水平，而后觀察下游事件，如基因表達(dá)，或者組蛋白或 DNA 修飾的水平的變化，來證實我們所預(yù)測的因果關(guān)系。以組蛋白甲基化修飾作用為例，甲基化轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶是 可用于干擾網(wǎng)絡(luò)中的特定節(jié)點。譬如我們要證實H3K27me3 抑制基因表達(dá)這一關(guān)系，我們可以通過抑制正常細(xì)胞或者癌細(xì)胞的組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶或者去甲基化酶來調(diào)節(jié) H3K27me3 水平，從而觀察下游基因表達(dá)水平的變化（圖 2）。實際上，一些已報道的因果關(guān)系正是利用上述方法和遺傳突變在模式生物或細(xì)胞實驗中發(fā)現(xiàn)的。驗證轉(zhuǎn)錄因子對某種組蛋白修飾的作用可以通過過表達(dá)或者 RNAi 轉(zhuǎn)錄因子來直接觀察到。我們將通過過表達(dá)或者RNAi 分別上調(diào)或者下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子，然后利用 ChIPqPCR 技術(shù)檢測一些已知的修飾位點或者利用 ChIPseq 技術(shù)在全基因水平檢測轉(zhuǎn)錄因子對全基因組范圍內(nèi)組蛋白修飾的影響。 圖 2： 如何通過干擾上游調(diào)控節(jié)點并以 ChIPPCR 和 ChIPseq 技術(shù) 檢測下游基因驗證預(yù)測模型中的關(guān)鍵調(diào)控關(guān)系 具體方案 如下： 課題 負(fù)責(zé)人：韓敬東，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所 學(xué)術(shù)骨干： 吳 旻 ，武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 染色質(zhì)與組蛋白的多種表觀遺傳學(xué)修飾 關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子與基因的調(diào)控關(guān)系 轉(zhuǎn)錄因子的 ChIPseq實驗 基因表達(dá)譜差異分析 染色質(zhì)構(gòu)型分析 表觀遺傳因子 ChIPseq實驗 絕緣子的基因組分布 表觀遺傳因子的基因組分布 轉(zhuǎn)錄因子的目標(biāo)基因分布 染色質(zhì)空間形態(tài)與 DNA、組蛋白修飾的因果調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子與目標(biāo)基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 多 因 素 SNP 與GWAS分析：鑒定腫瘤發(fā)病相關(guān)的重要基因突變相互關(guān)系 惡性腫瘤發(fā)病因素預(yù)測的因果網(wǎng)絡(luò)模型 RNAi與基因敲除研究：驗證腫瘤發(fā)病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與基因的影響范圍 惡性腫瘤高通量數(shù)據(jù)的整合與網(wǎng)絡(luò)的計算預(yù)測 四、年度計劃 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 一 年 1） 多種手段研究肺癌細(xì)胞腫瘤抑制基因甲基化狀況，開展腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān) DNA 甲基化標(biāo)志物研究；開展 PcG 蛋白表達(dá)變異與腫瘤抑制基因表觀遺傳失活關(guān)系研究； 2） 利用高通量芯片、 ChIPChip、ChIPseq、酵母雙雜交、免疫沉淀結(jié)合質(zhì)譜等技術(shù)，針對 TGFβ和雌激素信號通路相關(guān)因子，如轉(zhuǎn)錄因子 Smad ER 及其轉(zhuǎn)錄輔助因子，篩選新的組蛋白修飾基因或 miRNA； 3） 利用 RNASELEXseq 等技術(shù)平臺系統(tǒng)篩選鑒定與腫瘤相關(guān)蛋白相互作用的 ncRNA；檢測 ncRNA 的表達(dá)譜； 4） 誘導(dǎo)或抑制 EMT 表型。比較不同細(xì)胞系在 EMT 前后其基因表達(dá)譜變化， 用 MeDIPseq 法比較基因組范圍內(nèi) DNA 甲基化變化情況，并用 ChIPseq 法比較與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的主要的組蛋白修飾標(biāo)志如激活性的組蛋白乙?；?、 H3K4 甲基化，抑制性的 H3K9， H3K27， H4K20甲基化等在全基因組范圍內(nèi)的分布變化規(guī)律。 5） 分離乳腺良性增生患者及乳腺癌患者 微環(huán)境中的成纖維細(xì)胞 、 浸潤巨噬細(xì)胞 、 浸潤的單核巨噬細(xì)胞 ，分析 miRNA及 mRNA的表達(dá)譜，研究不同類型的乳腺癌以及不同侵襲轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌中上皮細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)譜差異 ； 6） 開發(fā)能夠自動整合并利用多個異質(zhì)實驗數(shù)據(jù)的因果推斷方法。 包括 去除反映單個數(shù)據(jù)源自身特征的背景信號，子網(wǎng)絡(luò)的拼接與集成，觀測型實驗數(shù)據(jù)與 (基 因敲1） 找出有代表性的腫瘤抑制基因，分析甲基化譜，篩選出一組腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān) DNA 甲基化標(biāo)志物；掌握腫瘤組織中多種 PcG 蛋白表達(dá)變異規(guī)律； 2） 獲得新的組蛋白修飾組分； 3） 篩選出一批腫瘤相關(guān)的 ncRNA；并確定 ncRNA 及相關(guān)蛋白的表達(dá)譜； 4） 優(yōu)化 EMT 表型誘導(dǎo)條件，完成基因表達(dá)譜及 MeDIPseq，ChIPseq法比較 DNA甲基化及主要組蛋白修飾譜變化實驗 ； 5） 發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)的不同 間質(zhì)細(xì)胞的表型特征，以及一些重要的免疫相關(guān)蛋白、間質(zhì)細(xì)胞中 miRNA及 mRNA的表達(dá)改變； 6） 建立 能夠自動整合并利用多個異質(zhì)實驗數(shù)據(jù) ，適用于大規(guī)模高噪聲的組學(xué)數(shù)據(jù) 的因果推斷方法 ，并開發(fā)為計算軟件 。 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 除、 RNA 沉默等 )干預(yù)型實驗數(shù)據(jù)的因果信息集成等多個問題。 第 二 年 1） 分析圍繞甲基化基因啟動子周圍的組蛋白修飾狀況，開展核小體在 DNA 甲基化擴展過程中的作用研究；開展腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)甲基化標(biāo)志物多中心驗證研究； 2） 利用免疫共沉淀、 GST pulldown、細(xì)胞內(nèi)共定位等蛋白質(zhì)間相互作用技術(shù)驗證篩選獲得的組蛋白修飾復(fù)合物中各成員間的相互作用，定位相互作用的結(jié)構(gòu)域 /區(qū)域。 3） 研究篩選到的 ncRNA 與蛋白質(zhì)、DNA 或 RNA 等生物大分子的相互作用； 4） 對克隆得到的 新的潛在 EMT 調(diào)控因子用分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)的手段進(jìn)行功能分析 ； 5） 通過基因過表達(dá)或敲降的方法，研究 差異表達(dá)的基因或 miRNA 對成纖維細(xì)胞 、巨噬細(xì)胞 及腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響，尤其是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響； 1） 探明組蛋白修飾與甲基化 DNA 之間的關(guān)聯(lián)性，證明核小體在 DNA甲基化擴展過程中的作用 ； 2） 明確組蛋白修飾復(fù)合物中各成員間的相互作用及其相互作用方式 ； 3） 初步確定 ncRNA 的作用靶點，特別是與蛋白的相互作用； 4） 發(fā)現(xiàn)一些 新的潛在 EMT 調(diào)控因子； 5） 發(fā)現(xiàn) 幾個間質(zhì) 細(xì)胞 來源的 與腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移 密切 相關(guān)的 新的分子 ； 6） 建立 能夠自動 進(jìn)行 因果關(guān)系的特征選擇方法 ，并開發(fā)為計算軟件 。探索 推斷腫瘤發(fā)生與發(fā)展動態(tài)關(guān)系 的方法 ； 7） 發(fā)表 56篇 IF5的研究論文 ,12篇 IF10 的研究論文。申請專利12 項。 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 6） 對于大規(guī)模因果推斷問題，使用現(xiàn)有的貝葉斯因果推斷方法，還面臨有限的數(shù)據(jù)資源與急劇增大的網(wǎng)絡(luò)搜索空間的矛盾。為了保證學(xué)習(xí)結(jié)果的魯棒性，我們擬開發(fā)一系列能保持因果關(guān)系的特征選擇方法來解決這個問題。 第 三 年 1） 研究影響 DNA甲基化和組蛋白修飾的關(guān)鍵酶，找出連接甲基化與組蛋白的蛋白。在不同病變?nèi)梭w組織中腫瘤 轉(zhuǎn)移相關(guān)基因 DNA 甲基化形成、擴展和維持規(guī)律研究； 2） 利用基因過量表達(dá)和敲低 /敲除技術(shù)、組蛋白修飾等分析技術(shù)檢測組蛋白修飾因子對組蛋白修飾的影響及不同修飾間的相互影響。檢測組蛋白修飾候選因子對 TGFβ、雌激素信號通路等相關(guān)的下游靶基因表達(dá)的影響。確定組蛋 白修飾復(fù)合物中各成員間物理上的相互作用與功能上的相互作用的關(guān)系； 3） 研究 ncRNA在表觀遺傳修飾和轉(zhuǎn)錄水平上對基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用 ；以及 ncRNA 相關(guān)的信號調(diào)控通路； 4） 對克隆得到的 新的潛在 EMT調(diào)控因子用分子生物學(xué)