【導(dǎo)讀】展惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的表觀遺傳學(xué)研究。本項(xiàng)目的總體目標(biāo)如下：闡。的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。支具有國際競爭力的研究團(tuán)隊(duì)。子；發(fā)現(xiàn)針對(duì)轉(zhuǎn)移型乳腺癌、肺癌的新的有效治療靶點(diǎn)。博士后12名以上。的表觀遺傳機(jī)制，為乳腺癌和肺癌的預(yù)防、診斷、治療提供分子標(biāo)志及藥物靶標(biāo)。白的修飾狀況，探討DNA甲基化與組蛋白修飾的先后關(guān)系?；姆肿訖C(jī)制，進(jìn)而揭示組蛋白修飾與DNA甲基化相互作用的分子機(jī)制。組合紊亂與腫瘤相關(guān)基因失活之間可能存在因果關(guān)系。本研究還將以多種器官的。正常組織和腫瘤組織為對(duì)象，了解正常組織細(xì)胞中PcG蛋白的正常組合關(guān)系，核小體定位和DNA甲基化發(fā)生的關(guān)系。將以功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的方法篩選乳腺癌和肺癌中發(fā)生突變。本課題將以乳腺癌細(xì)胞系、腫瘤組織、腫瘤啟動(dòng)細(xì)胞為模型，利用自。采用球囊形成實(shí)驗(yàn)、二維平皿及三維Matrigel培養(yǎng)以及免疫缺陷鼠體內(nèi)

　　

【正文】 及組蛋白修飾對(duì) Smad、 ER 等轉(zhuǎn)錄因子募集到靶 基因啟動(dòng)子上的作用；在細(xì)胞水平和小鼠腫瘤模型中檢測篩選到的候選分子在乳腺癌、肺癌等腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用和機(jī)制；收集大量臨床標(biāo)本，結(jié)合病理及預(yù)后等資料，檢測幾個(gè)候選分子及相應(yīng)的組蛋白修飾在乳腺癌、肺癌等腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的臨床意義。 利用課題組前期工作中建立的篩選與目標(biāo)蛋白相互作用的 ncRNA 的技術(shù)平臺(tái)（ RNASELEXseq），從腫瘤細(xì)胞系和腫瘤組織中篩選鑒定與腫瘤相關(guān)蛋白相互作用的 ncRNA，研究 ncRNA蛋白質(zhì)間相互作用的分子基礎(chǔ)、動(dòng)態(tài)時(shí)空關(guān)系以及功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò) ； 闡明 ncRNA 在表觀 遺傳修飾和轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用，深入探討它們?cè)谀[瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的意義；利用生物信息學(xué)和實(shí)驗(yàn) 相結(jié)合的方法鑒定以 ncRNA 為軸心，與之相互作用的蛋白質(zhì)、 RNA 和 DNA，發(fā)現(xiàn) ncRNA 新的作用機(jī)制 ，探討在細(xì)胞中是否存在一個(gè)通過 RNA蛋白相互作用而構(gòu)成的結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)和信息調(diào)控網(wǎng)絡(luò)； 在發(fā)現(xiàn)和鑒定的腫瘤特異性 ncRNA 及其相關(guān)蛋白的基礎(chǔ)上，用腫瘤啟動(dòng)細(xì)胞模型、腫瘤轉(zhuǎn)移模型（包括腫瘤細(xì)胞 EMT 模型） 以及臨床標(biāo)本， 深入探索具有臨床意義的 ncRNA 及其相關(guān)蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。 尋找新的 EMT 調(diào)控 因子以 及新的 EMT 相關(guān)調(diào)控通路，研究建立和維持 EMT的 信號(hào)通路之間的交互作用：一般來說， ER 陽性的乳腺癌細(xì)胞（如 MCF7細(xì)胞）轉(zhuǎn)移性弱，而 ER 陰性的乳腺癌細(xì)胞（如 MDAMB231 細(xì)胞）轉(zhuǎn)移性強(qiáng)。癌細(xì)胞 ER 表達(dá)陽性也是其對(duì)三苯氧胺等雌激素拮抗療法有反應(yīng)性的前提條件。但三苯氧胺對(duì)部分 ER 陽性的乳腺癌細(xì)胞治療效果較差。選取正常乳腺癌細(xì)胞、乳腺癌低轉(zhuǎn)移性、高轉(zhuǎn)移性、耐藥性的代表細(xì)胞系進(jìn)行表達(dá)譜分析，檢測它們是否具有 EMT 相關(guān)基因的表達(dá)差異。其中差異表達(dá)的除已知 EMT 基因外，未知功能的基因表達(dá)產(chǎn)物根據(jù)其功能域及蛋白質(zhì) 組學(xué)分析（如質(zhì)譜檢測其相互作用蛋白等方法）可研究其是否為新的 EMT 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子?；虮磉_(dá)譜差異分析可同樣應(yīng)用于以 lentivirus 在低轉(zhuǎn)移性細(xì)胞用shRNA 抑制 Ecadherin 促進(jìn)其 EMT，或高轉(zhuǎn)移性細(xì)胞引入 Ecadherin 表達(dá)后與原有細(xì)胞的對(duì)比研究中。已發(fā)現(xiàn)多種信號(hào)通路都與 EMT 相關(guān)。擬選取目前研究較為充分的 TGF?通路，以及 Wnt 和 NF?B 通路為代表，分別給予乳腺癌細(xì)胞相關(guān)信號(hào)分子刺激誘導(dǎo) EMT，隨后進(jìn)行基因表達(dá)譜、通路特異性蛋白質(zhì)譜以及高通量的細(xì)胞內(nèi)磷酸化修飾改變等分析，找到這些通路在 EMT過程中的共同靶點(diǎn)并闡明其在 EMT 中如何扮演關(guān)鍵角色。 建立可誘導(dǎo)表達(dá)熒光標(biāo)記的 Ecadherin 或其它 EMT 誘導(dǎo)因子的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，以在細(xì)胞及分子水平上實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的改變對(duì) EMT及細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。同時(shí)，研究這些分子及相關(guān)的通路與乳腺癌病人的轉(zhuǎn)移、療效、預(yù)后及藥物敏感性的關(guān)系，探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。 EMT 過程中 DNA 甲基化水平和組蛋白修飾在全基因組范圍內(nèi)的改變及 特異的組蛋白修飾酶如何參與調(diào)控 EMT： EMT 是已分化上皮細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)重編程的生物學(xué)行為，勢必有 DNA 甲基化及多種影響基因轉(zhuǎn)錄的組蛋白 修飾在全基因組范圍內(nèi)重新分布。利用 MeDIPseq 檢測細(xì)胞在發(fā)生 EMT 時(shí)在全基因組范圍內(nèi)的 DNA 甲基化變化規(guī)律。同時(shí)， 針對(duì) 特異性組蛋白化學(xué)修飾 如轉(zhuǎn)錄激活性的組蛋白乙?；?H3K4 甲基化，轉(zhuǎn)錄抑制性的 H3K9，H3K27， H4K20 甲基化等， 利用其特異性 抗體進(jìn)行 ChIPseq 分析，檢測細(xì)胞發(fā)生 EMT 時(shí)的組蛋白化學(xué)修飾變化規(guī)律。從以上兩方面的研究出發(fā)，進(jìn)而對(duì)潛在 EMT 關(guān)鍵基因進(jìn)行詳細(xì)的生物學(xué)功能研究。特異的組蛋白修飾酶可能在 EMT 調(diào)控中扮演關(guān)鍵角色。組蛋白 H3K27 三甲基化酶 EZH2 在乳腺癌中顯著高表達(dá)，并 與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及較差預(yù)后密切相關(guān)，提示其在 EMT 中亦可能扮演關(guān)鍵角色。 相關(guān) 課題組之前 發(fā)現(xiàn) 組蛋白 H3K4 去甲基化酶 LSD1 在TGF?信號(hào)通路及乳腺癌轉(zhuǎn)移中 起 重要作用 。 課題將進(jìn)一步以 EZH2 及 LSD1為 研究對(duì)象 ，通過基因組 學(xué) 及質(zhì)譜分析 ， 研究它們 和 已知的 EMT 相關(guān)的 轉(zhuǎn)錄因子 之間的 相互關(guān)系。 分離乳腺良性增生患者及乳腺癌 患者 微環(huán)境中的成纖維細(xì)胞，進(jìn)行原代培養(yǎng)后，分析 miRNA 及 mRNA 的表達(dá)譜，研究不同類型的乳腺癌（ 基底型、導(dǎo)管 A 型、導(dǎo)管 B 型、 HER2+/ER型、類正常乳腺型） ，以及不同侵襲轉(zhuǎn)移能力（高轉(zhuǎn)移、不轉(zhuǎn)移） 的乳腺癌中上皮細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)譜差異；通過基因過表達(dá)或敲降的方法，研究這些差異表達(dá)的基因或 miRNA 對(duì)成纖維細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響，尤其是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響；發(fā) 展三維細(xì)胞培養(yǎng)模式，將腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，盡量模擬體內(nèi)環(huán)境，研究這些差異表達(dá)的基因或 miRNA 對(duì)共培養(yǎng)后腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響 ，探討改變細(xì)胞微環(huán)境對(duì)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的影響。 從 髓系細(xì)胞在不同病理狀態(tài)下的乳腺組織中的浸潤和群體變化入手， 通過分析乳腺良性增生患者、乳腺癌組織的局部微環(huán)境中， 浸潤性的髓系細(xì)胞（包括浸潤的腫瘤相關(guān)性 巨噬細(xì)胞）的活化和表型特征，特異性表達(dá)基因的改變，分析在乳腺癌發(fā)生的微環(huán)境中，促進(jìn)單核細(xì)胞浸潤和分化發(fā)育成為 M2 型腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞的調(diào)控因素，探尋促進(jìn)乳腺細(xì)胞異常增殖分化的免疫細(xì)胞的相關(guān)因素和分子及其調(diào)控因素 ； 在我們已經(jīng)建立的三維模擬人體體外免疫系統(tǒng)模型基礎(chǔ)上，改進(jìn)并建立起進(jìn)行乳腺癌細(xì)胞 /靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞 /免疫細(xì)胞的共培養(yǎng)的三維模型 ； 通過活化髓系細(xì)胞，以及體外分化的 M2 型巨噬細(xì)胞，研究免疫細(xì)胞中的異常表達(dá)基因和分子對(duì)良性增生的乳腺細(xì)胞以及乳腺腫瘤細(xì)胞增殖和行為特征的影響 ； 并采用具有不同行為特征的腫瘤細(xì)胞以 及在腫瘤細(xì)胞中采用基因 過表達(dá)或敲除的方法， 研究探討其對(duì)浸潤的免疫細(xì)胞分化的影響 ； 通過制備同類系小鼠骨髓嵌合體，進(jìn)而在乳腺癌小鼠動(dòng)物模型中，確證相關(guān)免疫的細(xì)胞活化因子在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，并探討腫瘤細(xì)胞產(chǎn)物對(duì) 髓系抑制性細(xì)胞（ MyeloidDerived Suppressor Cells, MDSCs）產(chǎn)生的機(jī)制以及可能的阻斷途徑，從而在機(jī)體免疫水平探討阻斷腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的策略。 采用基因工程小鼠模型， 研究 TGFβ 信號(hào)通路 在腫瘤 微環(huán)境中與 REG?蛋白酶體激活因子、 p53 等重要腫瘤因子 動(dòng)態(tài)相互作用 及其動(dòng) 態(tài)調(diào)控的分子機(jī)制 ；在解析這些調(diào)控機(jī)制的生理病理意義的基礎(chǔ)上，通過腫瘤模型研究進(jìn)一步 闡明 腫瘤 微環(huán)境中重要 生物學(xué)因子對(duì) 腫瘤發(fā)生發(fā)展的決定性作用 ； 以正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞為模型，利用基因敲除等手段，近一步闡明 REG?蛋白酶體與TGFβ 信號(hào)通路間的相互調(diào)節(jié)以及信號(hào)反饋機(jī)制 ； 利用正常表達(dá)及缺失 REG?的 小鼠 （ C57BL/6 遺傳背景的 REG?+/+和 REG?/小鼠 ），通過雜交建立 Smad2亞等位基因表達(dá)（ hypomorphic expression）的小鼠 模型 ， 用化學(xué)致癌劑 在腫瘤易發(fā)及對(duì)照小鼠中誘導(dǎo)特定的癌癥模型 ， 通過 對(duì) 癌癥發(fā)生的普遍特征、腫瘤病理 組織學(xué)分析等研究來 探討 TGFβ 信號(hào)通路與 REG?蛋白 酶體的交互作用 。 利用腫瘤基因表達(dá)和表觀遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，采用計(jì)算生物學(xué)方法推測在惡性腫瘤、干細(xì)胞中發(fā)生變化的表觀遺傳學(xué)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。進(jìn)一步發(fā)展基于貝葉斯網(wǎng)絡(luò)的因果推斷方法。在惡性腫瘤與干細(xì)胞中分別預(yù)測基因表達(dá)與表觀調(diào)控網(wǎng)絡(luò) ,并進(jìn)一步比較其異同。通過干擾預(yù)測的上游調(diào)控節(jié)點(diǎn)后以 ChIPPCR 和ChIPseq 技術(shù)對(duì)下游節(jié)點(diǎn)進(jìn)行檢測，對(duì)以上預(yù)測模型中的關(guān)鍵調(diào)控關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證。