westernblot詳解及問(wèn)題分析(編輯修改稿)
2025-06-16 00:44 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 的機(jī)械強(qiáng)度和透明 度。是良好的電泳介質(zhì)。 Western Blot 聚丙烯酰胺凝膠的聚合方式： ? 單體：丙烯酰胺（ Acr）； ? 交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（ Bis）； ? 催化劑：過(guò)硫酸胺或核黃素（ AP）； ? 加速劑：四甲基乙二胺（ TEMED）； ? 產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠 ? 聚丙烯酰胺凝膠聚合機(jī)理是通過(guò)提供氧游離基 (free radicals)的催化，使體系發(fā)生氧化還原作用 (catalystredox systems)來(lái)完成的。催化體系主要有化學(xué)催化（ AP— TEMED）和光化學(xué)催化（核黃素 —— TMTED）體系。 Western Blot 凝膠濃度與蛋白分離范圍 凝膠濃度（％） 線性分離范圍（ KD) 15 1243 10 1668 3694 57212 SDSPAGE濃縮膠 (5% Acrylamide)及分離膠配方表： Western Blot 不連續(xù)電泳： 作用 緩沖液 PH 凝膠濃度 濃縮膠 使蛋白樣品濃縮 Cl 低， 25% 分離膠 使蛋白樣品分離 Cl 高，根據(jù)蛋白大小 電泳緩沖液： Tris甘氨酸系統(tǒng) 。 Western Blot 灌制分離膠 隔絕空氣 ddH2O %SDS:8% 異丁醇： 8% Western Blot 灌制積層膠 插入梳子 Western Blot Staking gel Separating gel Western Blot 轉(zhuǎn)膜 ? 要將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相載體（例如 NC膜）上，通常有兩種方法：毛細(xì)管印跡法和電泳印跡法 。 ? 常用的電泳轉(zhuǎn)移方法有 濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn) 。兩者的原理完全相同，只是用于固定膠 /膜疊層和施加電場(chǎng)的機(jī)械裝置不同。 Western Blot 轉(zhuǎn)移膜的選擇 ? 最常用于 Western Blot的轉(zhuǎn)移膜主要是硝酸纖維素（ Nitrocellulose， NC）膜和聚偏二氟乙烯 （ Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龍膜、 DEAE纖維素膜做蛋白印跡。尼龍膜和 NC膜的特點(diǎn)相似 ,主要用于核酸雜交。 ? 各種膜的詳細(xì)特點(diǎn)介紹： ? Western Blot 濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)
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