westernblot配方和方法(編輯修改稿)
2025-09-12 23:55 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平（梳子使用前保證干凈且干燥）。待到濃縮膠凝固后（室溫30min），將凝膠放入電泳槽中，小玻璃板面朝內(nèi)（若只跑一塊膠，則槽的另一邊要墊一塊塑料板，且有字的一面朝內(nèi)）。在上下槽內(nèi)加入電泳液，上槽內(nèi)的電泳液應(yīng)沒過小玻璃板上緣，下槽內(nèi)的電泳液應(yīng)沒過金屬絲，排除凝膠底部兩塊玻璃板之間的氣泡。加入電泳液后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。 用電泳液沖洗一下濃縮膠，（目的是去除梳子遺留下的未凝固的丙烯酰胺，以免造成條帶變形） 可以前一天配膠備用，保鮮膜4度保存，可一周。制備樣品：測完蛋白濃度后，計(jì)算含20—50μg蛋白（根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行選擇，沒有固定的量，一般為40—50ug。）的樣品體積即為上樣量。取出上樣樣品至200μl的EP管中，加入5SDS上樣緩沖液至終濃度為1（上樣緩沖液與樣品蛋白體積之比為1:4）。（上樣體積一般在10μl與20μl之間）（其實(shí)大一點(diǎn)的垂直電泳槽每孔最大上樣量可以達(dá)到40μl，膠做得很好的話，50μl問題也不大）上樣前要將樣品100℃加熱515min使蛋白變性，立即冰浴，然后低速離心5min。（可以使用PCR儀進(jìn)行變性（95℃,10min））應(yīng)根據(jù)上樣緩沖液濃度的不同，制備樣品。樣品分裝成小管，儲(chǔ)于80℃。蛋白質(zhì)在非變性條件下的電泳分離是由其分子量大小與電荷共同決定的，在變性條件下與SDS結(jié)合后，其電泳分離只由分子量大小決定。 加足夠的電泳液后準(zhǔn)備上樣。上樣之前一定要把上樣孔沖洗干凈，沖走未凝固的丙烯酰胺。用移液槍將樣品吸出，注意不要吸進(jìn)氣泡。將槍頭插至上樣孔中加入樣品（上樣速度要快，防止樣品擴(kuò)散導(dǎo)致相互影響，但上樣過快又會(huì)使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí)要換槍頭，以免交叉污染）。一般marker（Fermentas的0671或0441）加6ul。為避免邊緣效應(yīng)，最好選擇中間的孔上樣。 電泳：將電泳槽與電泳儀相接，紅接紅，黑接黑。跑濃縮膠時(shí)用80V，到分離膠后用120V。溴
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