【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 箱保存。 ② PY工作液：取 1mol/L， 沖液到 l00ml， 稀釋為 %濃度 (lmol/L 沖液的配制 : 冰醋酸 +蒸餾水 1000ml。 無水醋酸 鈉 +蒸 餾 水至 1000ml。 然后取冰醋酸液 255ml十245ml醋酸 鈉， 再加入 200ml蒸 餾 水即成 )。 ③ DNA酶消化液配制 :DNA酶 ， 酸， , 20mol/L TrisHCL調(diào) Ph為 ④取 1 106/ml細(xì)胞，加入 ， 37℃ 消化20分鐘，棄去 DNA酶液，加入 % PY工作液 ，室溫下染色 30分鐘， PBS洗去染液 ， 再加入 上機(jī)檢測(cè)。 2. 丫 啶 橙 (AO)RNA熒光染色 ： AO是 DNA/RNA 熒光標(biāo)記的優(yōu)良探針 ， 當(dāng) FCM DNA/RNA雙參數(shù)定量分析時(shí) ， AO只需要單一激發(fā)光488nm， 當(dāng)進(jìn)行 RNA單參數(shù)定量分析 ， 可先將細(xì)胞DNA用 DNase消化處理 ， DNA熒光就消失了 ， 再進(jìn)行RNA AO熒光染色 ， 這時(shí)所測(cè)熒光量?jī)H為 RNA含量 ，詳細(xì)染色方法 ， 請(qǐng)參見 DNA含量的 AO 染色。 AO染色的缺點(diǎn)是對(duì)管道的污染嚴(yán)重。 3. 甲基綠 － 派若寧 Y對(duì) RNA熒光染色 : 甲基綠 － 派若寧 Y都是堿性熒光染料 ， 甲基綠對(duì)細(xì)胞核 DNA 染色具有特異性 ， 這可能由于甲基綠的兩個(gè)正離子根與 DNA中陰離子的磷酸根相一致 ， 而且兩個(gè)正負(fù)離子距離相等 ， 甲基綠與 DNA分子的結(jié)合遠(yuǎn)強(qiáng)于派若寧 Y， 這主要與化學(xué)結(jié)構(gòu)式中 N基因有關(guān) ， 還有一個(gè)堿性更強(qiáng)的三 羥銨 鹵根 ， 而派若寧 Y中只有一個(gè) N基團(tuán) ， 因此派若寧 Y競(jìng)爭(zhēng)不過甲基綠與 DNA分子的結(jié)合。還有人認(rèn)為 ， DNA和 RNA的聚合程度不同 ，DNA聚合程度高 ， 甲基綠著色 ， RNA聚合度低與派若寧 Y結(jié)合。 但 DNA發(fā)生解鏈后便失去與甲基綠結(jié)合的能力 ，所以在染色過程中 ， 須防止 DNA解鏈效應(yīng)的發(fā)生 ， 甲基綠 PY對(duì) RNA的定量熒光染色 ， 主要依據(jù)其化學(xué)物理特性 ， 甲基綠與 DNA分子結(jié)合能力強(qiáng) ， 可以屏蔽派若寧 Y與 DNA分子的結(jié)合 ， 而達(dá)到 PY－ RNA染色 ， 對(duì)RNA單參數(shù)定量分析的目的。在甲基綠 PY染色 RNA時(shí) ， 必須嚴(yán)格控制染液的 PH值 ， 根據(jù)實(shí)驗(yàn)證明 ， 當(dāng) pH值高時(shí) ， PY不著色 ， 只有 pH值在 ， PY對(duì)RNA具有特異親合性 ， 當(dāng) pH值極低時(shí) ， 甲基綠不著色 ，就起不到屏蔽 PY與 DNA結(jié)合的作用 ， 甲基綠的 pH值在 57時(shí)都有很好的穩(wěn)定性 ， 與 DNA分子具有很強(qiáng)的特異性結(jié)合能力。 甲基綠 PY染色方法 ： ① 甲基綠染液的配制 ， 濃度 %， pH值 57。取甲基 綠 + 蒸餾 水 l00ml， 甲基綠配制后 ， 以純氯仿提純 ，由于甲基綠中混有甲基紫成分 ， 在染色時(shí) ， 需將甲基紫洗去。方法為 : 將甲基綠溶解后 ， 放入分液漏斗中 ，加等量的純氯仿洗 ， 先充分搖蕩數(shù)分鐘 ， 室溫下靜置 ，待該液分為兩層 ， 棄去下層的紫色氯仿 ， 按此方 法 反復(fù)洗 56次 ， 直到洗不下紫色為止 。 ② PY染液配制見前 。 ③ 取 1 106/ml單細(xì)胞樣品 ， 加入甲基綠 ， 室溫下染色 30分鐘 ， PBS離心洗滌一次。然后加入 ， 室溫下染 30分鐘 ， PBS離心洗一次 ， 加入 PBS 分析。 以上介紹的幾種 RNA 熒光探針各具優(yōu)缺點(diǎn) ， AO雖是 RNA定量分析的優(yōu)質(zhì)熒光染料 ， 但其染色過程復(fù)雜 ， 并對(duì)儀器管道污染嚴(yán)重 。 PY不足之處是其熒光量與 RNA含量缺乏嚴(yán)格的量效關(guān)系。還有作者報(bào)道用 HO/PY標(biāo)記 DNA/RNA熒光染色雖然具有重復(fù)性。染色過程簡(jiǎn)單 ，不污染管道 ， 但需要雙激發(fā)光源 ， 儀器操作復(fù)雜。 4. 噻唑 橙 (ThiazoIe orange TO) 是網(wǎng)織紅細(xì)胞 RNA熒光染色新探針 ， 計(jì)數(shù)網(wǎng)織紅細(xì)胞對(duì)于評(píng)價(jià)骨髓紅系造血活性以及對(duì)貧血性疾病的治療療效評(píng)價(jià)具有重要意義。 FCM已被引入定量分析網(wǎng)織紅細(xì)胞 RNA和計(jì)數(shù)網(wǎng)織紅細(xì)胞。派若寧 Y、 花青苷 類 DIOCl(3) 、 丫啶 橙和硫黃素 T等熒光探針被用于FCM分析網(wǎng)織紅細(xì)胞 RNA的熒光染色 。 雖然這些熒光探針?biāo)鶛z測(cè)的網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)與手工光鏡下計(jì)數(shù)有較好的相關(guān)性 ， 但均存在不足之處 ，PY DIOCl(3)和 AO與 RNA結(jié)合缺乏嚴(yán)格的量效關(guān)系。硫黃素 T(Thioflavin T)雖有較強(qiáng)的量效關(guān)系 ， 但其量子產(chǎn)額較低 ， 染色步驟較繁 ， 并與染料結(jié)合達(dá)到飽和狀態(tài)才能獲得精確的結(jié)果。另外 ， 流式組方圖常有抬高于基線的拖尾現(xiàn)象 ， 使資料分析困難 ， 計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確。 Lee等開發(fā)合成了新的熒光探針 噻唑 橙 (TO)，F(xiàn)CM分析用 TO標(biāo)記網(wǎng)織紅 RNA明顯優(yōu)于其他染料 ，TO熒光發(fā)射強(qiáng) ， 光量子產(chǎn)額大 ， 染色程序簡(jiǎn)單 ， 數(shù)據(jù)分析比 PY和 DIOCl(3)更簡(jiǎn)單 ， TO與甲基蘭計(jì)數(shù)網(wǎng)織紅的相關(guān)更好 ， 相關(guān)系數(shù)為 ， TO染色計(jì)數(shù)網(wǎng)紅細(xì)胞更精確 ， 優(yōu)于甲基蘭染色的人工計(jì)數(shù) ， 膜滲透性好 ，可以作為活性熒光染料。 TO染色具體方法 ： ① 用甲醇液配制 lmg/ml TO儲(chǔ)備液 。 儲(chǔ)備液用 PBS稀釋為 1:1000， 稀釋液放在暗處室溫下至少可用 1周 。 ② 取全血 5μl加入 1ml TO稀釋液 ， 室溫下染色 1小時(shí) ，上機(jī)分析 ， 用藍(lán)綠色 488nm激發(fā) ， 發(fā)射熒光為 530nm。 ㈢ 蛋白質(zhì)含量熒光染色 1. 總蛋白質(zhì)含量的熒光標(biāo)記 ： 定量細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的含量分布 ， 可以揭示不同細(xì)胞群體 ， 并可了解一個(gè)細(xì)胞群體的生長(zhǎng)繁殖和代謝狀態(tài) 。 細(xì)胞總蛋白質(zhì)含量的流式檢測(cè) ， 其常用的熒光探針多為酸性熒光染料 ， 蛋白質(zhì)的熒光染色受著酸性熒光染料離子化狀態(tài)和染色溶液pH值的影響 ， 當(dāng) pH值為堿性 ， 堿性蛋白質(zhì)與酸性染料結(jié)合 。 當(dāng) pH值降低時(shí) ， 細(xì)胞的總蛋白被染色 。 因此 ， FCM檢測(cè)細(xì)胞總蛋白含量常用的熒光染料為異硫 氰 酸熒光素 ( Fluorescein isothiocyanate FITC)。 FITC是一種酸性熒光染料 ， 以共價(jià)鍵結(jié)合方式與蛋白帶有正電荷的位點(diǎn)結(jié)合 ， 以 氬 離子激光的 488nm激發(fā) ， 發(fā)出亮綠色熒光 ， FITC染色 pH值多偏于中性 ， 而避免染液偏堿性 。 先配制 FITC的染液濃度為 lmg/ml， 在純酒精中制備成為貯備液 ， 使用時(shí)用 PBS()稀釋成所需工作液 ， 在 FCM的定量細(xì)胞蛋白質(zhì)含量時(shí) ， 往往是雙參數(shù)分析 ， 多采用FITC/PI或 FITC/DAPI雙染色 。 2. 功能蛋白質(zhì)的熒光標(biāo)記 ： 流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用 ， 成為現(xiàn)代免疫技術(shù)的重要進(jìn)展之一 ， 特別是 FCM與單克隆抗體技術(shù)的有機(jī)結(jié)合 ， 極大地推動(dòng)了免疫學(xué)的發(fā)展 ， 使傳統(tǒng)免疫學(xué)提高到定量免疫研究水平。特別是各種熒光探針標(biāo)記的單克隆抗體 ， 為FCM研究各種細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)各種功能性抗原、腫瘤基因蛋白等發(fā)揮著重要的作用。下面將介紹流 式免疫技術(shù)中常用的免疫熒光探針 。 在流式免疫技術(shù)中 ， 熒光探針是極為關(guān)鍵 的 , 對(duì)熒光試劑使用尤其是具有一些特殊要求。 ①熒光染料必須應(yīng)有較高的量子產(chǎn)額和消光系數(shù) 。 ②熒光染料對(duì)某一激發(fā)光的波長(zhǎng)有較強(qiáng)吸收 。 ③激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間要有較大的波長(zhǎng)差別 ，以便使熒光發(fā)射強(qiáng)度與激發(fā)光所造成背景區(qū)分開 。 ④易于與被標(biāo)記的抗原 、 抗體和其他一些生物分子物質(zhì)結(jié)合 ， 又不影響被標(biāo)物質(zhì)的特異性。 FITC是免疫熒光標(biāo)記最常用的熒光探針 ，它的一些理化特性已在蛋白質(zhì)熒光染色一節(jié)中敘及。 FITC易溶于水 ， 很容易以共價(jià)鍵方式標(biāo)記在抗原、抗體等生物分子物質(zhì)上 ， 有較高的量子產(chǎn)額和消光系數(shù) ， 與 488nm激發(fā)波長(zhǎng)相匹配。是免疫熒光標(biāo)記的優(yōu)良染料 ， 但也有一些缺點(diǎn) ， FITC發(fā)射熒光強(qiáng)度受 pH值的影響 ，當(dāng) pH值低時(shí) ， 熒光減弱 ， 另外 ， FITC受激發(fā)射的光譜波長(zhǎng)常受到末染色細(xì)胞本身自發(fā)熒光的干擾 ， 所以在測(cè)量時(shí) ， 必須排除減去本底熒光。 FITC被廣泛用于標(biāo)記各種特異性抗體 ， 如抗蛋白類、脂蛋白、糖蛋白、多核 苷 酸、脂類等及其他生物分子和非生物分子 (例如熒光塑料微球 )， 利用被熒光標(biāo)記的生物分子可以檢測(cè)生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的多種參數(shù)。例如細(xì)胞內(nèi)或表面抗原、受體，基因蛋白產(chǎn)物，以及熒光原位雜交 (Filmrescenee in Situ Hybridism 、FISH) DNA探針檢測(cè)技術(shù)，對(duì)染色體上原癌基團(tuán)，結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因的變異進(jìn)行分析。利用熒光標(biāo)記的特異生物分子方法，為活細(xì)胞、死細(xì)胞中各種抗原、受體、基因等物質(zhì)的研究提供強(qiáng)有力的手段 。 近年來 ， 除了 FITC作為常用的免疫熒光的探針外 ，又 開發(fā)合成了很多新的免疫熒光的染料。最 主 要的 新 熒光 探針 是藻 膽 蛋 白 族 (Family of phycobili proteins)， 主要包括三種類型 ① 藻紅蛋白 (Phyloerythrin PE) ② 藻青蛋白 () ③ 別 藻 青 蛋 白(Allornwhey. amim. APC) ,藻膽蛋白是來自于光合青藻和紅藻菌類的自然熒光色素。藻膽蛋白很適合標(biāo)記各類抗體 ,由于它的分子結(jié)構(gòu)是幾個(gè)帶有開鏈四 吡 咯色基的多 肽 混合物。 標(biāo)記抗原抗體具有以下特點(diǎn) ： ①不同類別的藻膽蛋白可以在廣泛的激發(fā)光譜下被有效的激發(fā) ， 但其熒光發(fā)射波長(zhǎng)變化不大 。 ②由于藻膽蛋白分子具有許多發(fā)光色基因 ， 它的消光系數(shù)和光量子產(chǎn)額很高。 ③激發(fā)光和發(fā)射光易區(qū)別 ， 這由于藻膽蛋白的斯特科 斯(Stokes )位移大 。 ④它易溶于水 ， 不受 pH的影響 ， 熒光不易發(fā)生 淬 熄現(xiàn)象 。 ⑤與抗原、抗體及生物分子偶聯(lián)形成的標(biāo)記物 ， 不造成抗體活性的降低。 雖然藻膽蛋臼被廣泛用于免疫熒光探劑 ， 但也存在一些不足 ， 由于其分子量較大 ， 對(duì)細(xì)胞內(nèi)分子抗原、受體等不易標(biāo)記 ， 與標(biāo)記物結(jié)合后易形成色素脫落 ，標(biāo)記后保存時(shí)間短等 ， 也影響其推廣應(yīng)用。 在藻膽蛋白熒光探針家族中 ， 常采用的免疫熒光標(biāo)記是藻紅蛋白 ， 在藻蛋白中 RPE最常用 ， 但有作者研究發(fā)現(xiàn) ， 在 488nm光譜的激發(fā)下 ， SPE溶液的熒光發(fā)射強(qiáng)度比 FITC強(qiáng) 19倍 ， 比 RPE溶液發(fā)射熒光強(qiáng) 2倍。因此 SPE可以與 FITC或 PI等熒光染料同時(shí)作為雙參數(shù)標(biāo)記的優(yōu)良熒光探針。 流式細(xì)胞術(shù)可同時(shí)對(duì)一群生物細(xì)胞內(nèi)外的抗原物質(zhì)進(jìn)行免疫熒光的雙參數(shù)或三參數(shù)標(biāo)記的檢測(cè) ， 在進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)記或多參數(shù)標(biāo)記時(shí) ， 應(yīng)考慮到免疫熒光染料與激發(fā)光源 ， 以及熒光染料之間的相互組合的問題 ， 以避免使用