核酸提取及常見問題分析ok(編輯修改稿)
2025-06-14 21:40 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 用量 ? 菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失） 細(xì)胞裂解 ? 材料應(yīng)適量，過多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致 DNA量少，純度低 ? 針對不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式： ? 植物材料－－液氮研磨 ? 動(dòng)物組織－－勻漿或液氮研磨 ? 組培細(xì)胞－－蛋白酶 K ? 細(xì)菌－－溶菌酶破壁 ? 酵母－－破壁酶或玻璃珠 ? 高溫溫浴時(shí)，定時(shí)輕柔振蕩 基因組 DNA的提取 質(zhì)粒 DNA的提取 ? 菌體量適當(dāng) ? 培養(yǎng)基去除干凈，同時(shí)保證菌體在懸浮液中充分懸浮 ? 變性的時(shí)間不要過長（ 5分鐘），否則質(zhì)粒易被打斷 ? 復(fù)性時(shí)間也不宜過長，否則會(huì)有基因組 DNA的污染 ? G＋ 菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先用酶法或機(jī)械法處理，以破壁 核酸分離、純化 ? 采用吸附材料吸附的方式分離 DNA時(shí)，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系 ? 采用有機(jī)（酚 /氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作要輕柔 ? 離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間 ? 針對不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法 基因組 DNA的提取 質(zhì)粒 DNA的提取 核酸分離、純化 ?蛋白質(zhì)的去除： ? 酚 /氯仿抽提 ? 使用變性劑變性（ SDS、異硫氰酸胍等） ? 高鹽洗滌 ? 蛋白酶處理 ?多糖的去除： ? 高鹽法：用乙醇沉淀時(shí)，在待沉淀溶液中加入 1/2體積的 5M NaCl，高鹽可溶解多糖。 ? 用多糖水解酶將多糖降解。 ? 在提取緩沖液中加一定量的氯苯 (1/2體積 )，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖 。 ? 用 PEG8000代替乙醇沉淀 DNA：在 500μ L DNA液中加入200μ l 20% PEG8000 (含 M NaCl) ，冰浴 20min。 核酸分離、純化 ?多酚的去除： ? 在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑： β 巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等 ? 加入易與酚類結(jié)合的試劑：如 PVP、 PEG(聚乙二醇 )，它們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與 DNA的結(jié)合 核酸分離、純化 ?鹽離子的去除： ? 70％的乙醇洗滌 核酸沉淀、溶解 ? 當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分 ? 沉淀時(shí)加入 1/10體積的 NaAc（ ， 3M），有利于充分沉淀 ? 沉淀后應(yīng)用 70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等 ? 晾干 DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥） ? 若長期儲(chǔ)存建議使用 TE緩沖液溶解 ? TE中的 EDTA能螯和 Mg2+或 Mn2+離子，抑制 DNase ? pH值為 ，可防止 DNA發(fā)生酸解 基因組 DNA的提取 質(zhì)粒 DNA的提取 1. DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì) 2. DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng) 3. DNA中殘留有金屬離子 1. 重新純化 DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)（具體方法見前） 2. 重新沉淀 DNA，讓酒精充分揮發(fā) 3. 增加 70％乙醇洗滌的次數(shù)（ 23次） DNA提取常見問題 ?問題一： DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和 PCR反應(yīng)。 原因 對 策 1. 材料不新鮮或反復(fù)凍融 2. 未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性 3. 提取過程操作過于劇烈， DNA被機(jī)械打斷 4. 外源核酸酶污染 5. 反復(fù)凍融 1. 盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融 2. 液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液 3. 在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的 DNA時(shí)，可增加裂解液中螯合劑的含量 4. 細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔 5. 所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌 6. 將 DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融 DNA提取常見問題 ?問題二： DNA降解。 對
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