【文章內容簡介】 金和人力對艾滋病疫苗以及艾滋病病毒的分子生物學和免疫學進行研究，希望能早日遏止艾滋病在世界范圍內尤其是發(fā)展中國家不斷加速的蔓延趨勢。本研究在前期研究工作的基礎上，通過大量的查新， 構建 了表達病毒跨膜 蛋白 gp41 的核酸疫苗，并對其進行了實驗性免疫研究，為進一步研究抗 HIV1 病毒的 DNA疫苗提供可借鑒的技術數(shù)據(jù)。 材料與方法 1 材料 質粒、菌株和細胞 質粒 pIRES， gp41 基因 由軍事醫(yī)學科學院十一所病毒室 保存； 大腸桿菌 DH5a，克隆 載體 的宿主菌 軍事醫(yī)學科學院十一所病毒室 保存； BHK21 細胞系 ， 軍事醫(yī)學科學院十一所病毒室 保存 。 工具酶和主要試劑 內切酶 EcoR I 購自大連寶生物工程公司； T4 DNA ligase、 Klenow 大片段、 Ex Taq 酶、 LA Taq DNA 聚合酶、 RNase， CytoTox 96174。 NonRadioactive Cytotoxicity Assay kit 購自 Promega 公司產品； TRIZOL LS Reagent， Invitrogen 公司產品； FITC（異硫氰酸熒光素）標記的羊抗 人 IgG 購自 Promega 公司； DNA Marker、瓊脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物 、 DNA 回收試劑盒、乙二胺四乙酸 （ EDTA） 、十二烷基磺酸鈉 （ SDS） 、溴化乙錠 （ EB） 、 PEG8000、 NaOH、 NaCl、 CaCl LiCl、 瓊脂糖、胰蛋白胨、酵母抽提物等均為 GIBCO、 Invitrogen、 TaKaRa、 Sigma 和華美生物工程公司產品 ； 其它常規(guī)生化試劑均為分析純級。 主要儀器 高速低溫離心機， Hermle 公司產品；高速常溫離心機， Hermle 公司產品； DNA/RNA測量儀（ DNA/RNA Counter）， Pharmacia 公司產品； PCR 擴增儀（ Gene Amp PCR System 9600），PERKINELMER 公司產品； 70℃ 超低溫冰箱， SANYO 公司產品； CO2培養(yǎng)箱， SANYO 公司產品； GIS 凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司產品；熒光倒置顯微鏡， Olympus 公司產品；倒置顯微鏡， Olympus 公司產品； SORVALL174。 ULTRA Pro80 高速冷凍離心機，美國科峻 (Kendro)儀器公司的產品； Universal 16R 高速臺式冷凍離心機 (Sigma)； Himac CR21低溫高速離心機 (HITACHI)；恒溫搖床（武漢科學儀器廠）；高壓電泳儀（北京六一儀器 11 廠）； TZK800Z 型紫外可見分光光度計（秦州無線電儀器廠）； SMW3800 微波爐（ Japan）；微量恒溫器（上海蒲江分析儀器廠 ）； 酸度計 (Beckerman)。 各種溶液及培養(yǎng)液 （ 1） 10% SDS： SDS 50g，濃鹽酸調 pH ，加蒸餾水定容至 500 ml。 。 （ 2） 1 mol/L Tris： Tris ，加蒸餾水定容至 1000 ml。 （ 3） mol/L EDTA： EDTANa2H 2O ，加蒸餾水約 800 ml，劇烈攪拌，加 NaOH調 pH ，加蒸餾水定容至 1000 ml，高壓蒸汽滅菌。 （ 4） TE（ pH ）： 1 mol/L Tris 10 ml， mol/L EDTA 2 ml，調 pH ，加蒸餾水定容至 1000 ml，高壓蒸汽滅菌。 （ 5） 50TAE ： Tris ，冰醋酸 ml， mol/L EDTA（ pH ） 50 ml，加蒸餾水定容至 500 ml。 （ 6） 100 mmol/L CaCl2： CaCl26H 2O ， 加蒸餾水定容至 200 ml，高壓蒸汽滅菌。 （ 7）溶液Ⅰ ：葡萄糖 ， 1 mol/L TrisHC1 ml， mol/L EDTA 2 ml，調 pH ，加蒸餾水定容至 100 ml，高壓蒸汽滅菌 15 min。 （ 8） 溶液Ⅱ ：根據(jù)實驗需要現(xiàn)用現(xiàn)配，取適量體積 2 mol/L NaOH 與 10% SDS 混合后進行 10倍稀釋，使其終濃度分別為 mol/L NaOH 與 1% SDS。 （ 9） 溶液Ⅲ ： KAc ， 冰醋酸 ml，加蒸餾水定容至 100 ml。 （ 10） 10 mg/ml RNase：無 DNase 的胰 RNase 溶于 10 mmol/L TrisCl （ pH ）、 15 mmol/L NaCl，配成 10 mg/ml 的濃度， 100℃ 加熱 15 min，冷卻至室溫，分裝 成小份保存于 20℃ 。 （ 11） LB 培養(yǎng)基（ pH ）： Tryptone 1g， Yeast Extract ， NaCl 1g，調 pH ，加蒸餾水定容至 100 ml，高壓蒸汽滅菌 20 min。制備平板時加入 的瓊脂粉。 （ 12） 5 mol/L LiCl： LiClH 2O ，加蒸餾水定容至 100 ml，高壓蒸汽滅菌 20 min。 （ 13）堿性磷酸酶緩沖液： 100 mmol/L NaCl， 5mmol/L MgCl2， 100 mmol/L TrisCl pH 。 （ 14） MEM原液：稱取 MEM 1g 溶于 100 ml 四餾水中，高壓滅菌后備用。 （ 15） MEM 完全培養(yǎng)液：取 MEM 原液 100 ml，谷氨酰胺 2 ml，蒽諾沙星 4 ml，小牛血清 5%，用 % NaHCO3 調至培養(yǎng)液呈紅色。 （ 16） MEM 維持液：除小牛血清為 2%以外，其余成分與 MEM 完全培養(yǎng)液相同。 （ 17） NBT/BCIP 顯色液： 66 ml NBT 溶液（ NBT 溶于 10 ml 70%二甲基甲酰胺溶液中）和 10 ml 堿性磷酸酶緩沖液（ 100 mmol/L NaCl， 5 mmol/L MgCl2， 100 mmol/L TrisCl ）混勻，加入 33 ml BCIP 溶液（ BCIP 溶于 10 ml 100%二甲基甲酰胺液中）， 12 此顯色液應在 30 min 內使用。 2 實驗方法 基礎實驗操作方法 感受態(tài)細胞的制備 （ 1） DH5α， JM109 菌液（無質粒）用 50%甘油保存于 70℃，取出解凍后，吸取 200μ l 菌液，在 Amp瓊脂平板表面涂勻， 37℃培養(yǎng) 12h（過夜）。 （ 2） 用牙簽挑取單個菌落，接種于 3ml Amp LB 液體培養(yǎng)基中， 37℃，振蕩培養(yǎng)過夜（ 250tpm） 。 （ 3） 按 1%接種到 250ml（或 100ml）預冷的 Amp LB 培養(yǎng)液中， 37℃，振蕩培養(yǎng)到OD600=（或 ～ 或 ～ ）左右，約 1~2h 即可。 （ 4） 冰浴 30min（或 10min），冷卻至 0℃。 （ 5） 5000r/min， 4℃，離心 10min，（ 250 離心管 ， 收集菌體 ） 。 （ 6） 菌體懸浮于 體積的預冷 CaClTris HCl 溶液中（注 : 100mmol/L CaCl2，10mmol/L Tris HCl （ ）），冰浴 15min。 4℃， 5000r/min 離心 5~15min。 （ 7） 棄上清，菌體重懸于 2mL 含 15%甘油的 Tris CaCl2液中。 （ 8） 以 100μ l/Eppendorf 管分裝， 70℃保存。 質粒的轉化 （ 1） 取凍存的感受態(tài)菌一支（ 100μ l菌液，冰盒），冰浴 10min（化開即可）。 （ 2） 取適量質粒（質粒＜ 1μ l，連接產物＜ 10μ l， DNA≤ 50ng），加入到 100μ l～ 200μ l感受態(tài)菌中，充分混勻 （ ≥ 20:1） ，冰浴 30 min （ or 時間稍長）。 （ 3） 立即 42℃水浴熱沖擊 90s（勿動試管）。 （ 4） 立即冰浴 10 min。 （ 5） 無菌條件下每管（ Eppendorf 管）加 5體積（ 800～ 1000μ l） 37℃預熱的LB 培養(yǎng)液（無 Amp）。 （ 6） 37℃振蕩培養(yǎng) 40～ 60 min（時間不宜過長，轉速不宜過高，主要作用使細菌復蘇）。 （ 7） 4000r/min 離心 1 min，倒掉大部分上清液，將其作為菌液（約 50～ 100μ l）涂于LB（ Amp+）平板上（每 1ml培養(yǎng)液加 1μ L 50μ g/ml Amp，實際操作中加 2體積的） Amp。 （ 8） 37℃培養(yǎng)過夜（ 14～ 16h），獲得透明、 粟 粒狀單菌落。 質粒的小量制 備 （ 1）用牙簽挑取經實驗一獲得的單個菌落（含質粒），接種到 2～ 5ml LB 培養(yǎng)液中（試管）（每 ml培養(yǎng)液加 1～ 2μ l 50μ g/ml Amp）， 37℃振蕩過夜（ 250r/min， 12~16h）。 13 （ 2）分裝至 Eppendorf 管中（同時保存少量菌種供以后大提或擴菌用）， 4℃， 120xxr/min， 離心 1 min。 （ 3）收集菌體，棄上清，倒置濾紙上空干。 （ 4）將菌體放于冰盒上，重懸于 100μ l 冰預冷的溶液Ⅰ中，劇烈振蕩均勻（用震蕩器），充分懸浮，不要有沉淀塊，冰浴 10min（也可直接下 一步）。 （ 5）加 200μ l的新配制的溶液Ⅱ，蓋緊輕輕倒轉 3~5 次以混合內容物，不要強烈振蕩，絕對混勻后呈半透明膠體狀，冰浴 3～ 5min（以完全澄清為度，不宜過久）。 （ 6）加 150μL 冰預冷的溶液Ⅲ，溫和震蕩 10s 后，冰浴 5~15 min（可延長時間）。 （ 7） 4℃， 10000～ 120xx r/min， 離心 10 min。 （ 8）取上清，用等體積酚抽提 ， 顛倒幾次，混勻后 4℃， 120xxr/min，離心 8～ 10 min，取上清移至另一個 Eppendorf 管中。 (此步可省略 ) （ 9）用等體積酚：氯仿、異戊醇（ 25∶ 24∶ 1）抽提， 4℃， 120xxr/min 離心 8～ 10 min，取上清移至另一個 Eppendorf 管中。 （ 10）用等體積酚∶氯仿∶異戊醇（ 25∶ 24∶ 1）再次抽提， 4℃， 120xxr/min，離心 8～10 min，取上清移至另一個 Eppendorf 管中。（此步可省略） （ 11）用等體積氯仿、異戊醇（ 24∶ 1）抽提， 4℃， 120xxr/min 離心 10min，取上清移至另一個 Eppendorf 管中。 （ 12）加 體積的 3mol/L 醋酸鈉，用 2體積的冷無水乙醇沉淀質粒 DNA， 20℃放置 2h或更長 時間， 4℃， 120xxr/min，離心 10～ 15 min。（有資料表明在 20℃沉淀會有較多鹽析出，建議在室溫放置 2min 沉淀 DNA） （ 13）棄上清，加入 70%（ 4℃）乙醇振蕩漂洗沉淀，徹底去上清，用消毒后的濾紙條小心吸凈管壁上的乙醇水珠（殘留后會對后續(xù)工作中使用的酶產生一定的影響），將管倒置放在濾紙上，室溫下蒸發(fā)痕量乙醇 10～ 15min（實際操作中可置于 37℃溫箱中30min）。 （ 14）加入 20～ 25μ lRTE（ ）（含無 DNA 的 RNA 酶 20μ g/ml 的 TE 溶液），溶解 DNA， 37℃水浴 1h 后可進行內切酶酶切實驗或－ 20℃貯存（對于目的質?？捎糜谠俎D化感受態(tài)） 質粒的大量制備 （ 1）用牙簽挑取單個菌落接種于 2～ 5ml（ Amp+） LB培養(yǎng)基中， 37℃振蕩（ 220r/min）培養(yǎng) 12h左右（或過夜）。（此步應設無菌對照，同時可取少量作為菌種保存） （ 2）以 1%接種于 200ml 高壓 LB 培養(yǎng)液中， 37℃振蕩培養(yǎng) 12～ 18h， OD600＝ 左右時（約 12h），倒入 250ml 離心管中，置冰上 10 min（此步亦可留取菌液作種用）。 14 （ 3） 7000r/min， 4℃ ， 離心 15min。 （ 4）棄上清，倒置于濾紙上 空 干。 （ 5）放于冰盒中，重懸于 5ml 溶液Ⅰ（冰預冷），振蕩懸浮，不要有沉淀塊。 （ 6）加溶液Ⅱ 10ml（ 5mL 2%SDS+5mL NaOH） 混勻 5～ 7次，可以輕輕轉動管，動作要慢、輕，使之粘稠、半透明膠體狀，冰?。ɑ蚴覝兀?5 min（可以縮短，切忌延長）。 （ 7）加 溶液Ⅲ，上下顛倒混勻，同上步操作，此步絕對避免強烈振蕩。全部形成白色小塊狀，要徹底。冰浴 15min，形成白色絮狀沉淀，此時可見溶液清亮。（溶液Ⅰ∶Ⅱ∶Ⅲ =1∶ 2∶ ） （ 8） 4℃， 7000 r/min，離心 10～ 15min。 （ 9）將上清倒入 50 ml 離心管中，加 體積的（或等體積）異丙醇沉淀 DNA，室溫30min 以上或 4℃過夜。 （ 10） 9000~10000 r/min， 室溫離心 15min。（ 4℃離心將導致大部分鹽析出混入沉淀），小心棄上清。 （ 11）用冷的 70%乙醇 （ 1～ 2ml） 漂洗 1 次， 120xxr/min 離心 2～ 5min，倒掉乙醇，室溫干燥或真空抽干。（此步省略） （ 12）溶于 的 TE（ ）緩沖液中，放置室溫，待沉淀周邊溶解以后，搖勻使之全部溶解